糖的核磁共振性质课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节 糖的核磁共振性质,一、糖的,1,HNMR性质,1、糖的端基质子信号在5.0ppm附近，多数呈现特征性的双峰，少数呈现宽单峰。,2、糖环质子信号在3.54.5ppm之间。,3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基质子信号在1.0 ppm附近.,第五节 糖的核磁共振性质一、糖的1HNMR性质,1,4、糖的C,1,-H与C,2,-H的偶合常数，广泛应用于,吡喃糖环端基碳原子构型,的判断。,原理：绝大多数的D-吡喃糖(如葡萄糖),当,C,1,-OH处于横键上(,代表-苷键,),C,1,-H与C,2,-H的,偶合常数J=6-8Hz;当C,1,-OH处于竖键上(,代表,-苷键,),C,1,-H与C,2,-H的偶合常数J=2-4Hz。,原因：,质子间的偶合常数与两面角有关。,4、糖的C1-H与C2-H的偶合常数，广泛应用于,2,C,2,-H始终处于竖键上是判断的前提。,甘露糖与鼠李糖，虽然具有吡喃环结构，但其,C,2,-H都处于横键上，,故无法判断其苷键构型。,2,2,C2-H始终处于竖键上是判断的前提。22,3,鼠李糖优势构象是1C式,1,2,1,2,1,1,2,2,3,3,鼠李糖优势构象是1C式1212112233,4,-L-鼠李糖苷,-L-鼠李糖苷,=60,0,=60,0,C,1,-L-鼠李糖苷-L-鼠李糖苷=600=600C1,5,二、糖的,13,CNMR性质,（一）化学位移与偶合常数,1、D-吡喃糖的化学位移值,C,1,:-型 97,101 ppm,-型 103,106 ppm,CH-OH(C,2,、,C,3,、C,4,)70,78ppm,CH,2,-OH(C,6,)62ppm左右,CH,3,（糖的甲基C）18ppm左右,二、糖的13CNMR性质,6,一般在,13,C-NMR谱中,2、D-呋喃糖的化学位移值,CH,2,-OH(C,1,)64 ppm左右,CH-OH（,C,3,、C,5,）80ppm（偏大）,一般在13C-NMR谱中 2、D-呋喃糖的化学位移值,7,3、,13,C谱化学位移数据的应用,依据97,106ppm区域,13,C信号的个数可,判断低聚糖及其苷中所含糖基的个数.,如果端基,13,C信号出现在,大于100ppm,的,区域，则,苷键构型为-D或-L,；,如果端基,13,C信号出现在,小于100ppm,的,区域，则,苷键构型为-D或-L,。,3、13C谱化学位移数据的应用,8,依据,13,C谱数据尚可判断氧环的大小。,对于呋喃氧环,CH-OH（,C,3,、C,5,）80ppm,对于吡喃氧环,CH-OH（,C,3,、C,5,）78ppm,依据13C谱数据尚可判断氧环的大小。,9,4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常数(,1,J,C1-H1,),可用于苷键构型的确定.,对于D-吡喃糖甲苷：,-苷键 J,C1-H1,165170Hz,-苷键 J,C1-H1,155160Hz,例如：-D-甘露糖甲苷,1,J,C1-H1,=166ppm;,-D-甘露糖甲苷,1,J,C1-H1,=156ppm。,4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常数(1JC1-H1),10,对于L-鼠李糖甲苷：,-苷键 J,C1-H1,165170Hz,-苷键 J,C1-H1,155160Hz,例如：-L-鼠李糖甲苷,1,J,C1-H1,=168ppm;,-L-鼠李糖甲苷,1,J,C1-H1,=158ppm。,5、呋喃型糖苷无法用端基碳与端基质子,的偶合常数来判断其苷键构型。,对于L-鼠李糖甲苷：,11,（二）苷化位移（glycosydation shift）,1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元-C、,-C的化学位移值均发生改变，这种苷化前后,化学位移的变化现象，称为苷化位移。,端基碳,苷元碳,（二）苷化位移（glycosydation shift）端基,12,2、苷化位移一般规律,端基碳、苷元,-碳,的化学位移值向低场,方向移动56ppm（,+,5,+,6）单位；,苷元-碳的化学位移值向高场方向移动,34ppm（,-,3,-,4）单位；,糖分子其他碳原子化学位移值变化不大。,苷元-位有取代基时的苷化位移规律：,2、苷化位移一般规律,13,苷元-碳,和,糖端基碳,绝对构型都为R,（或S）时，苷化位移规律同、。,端基碳,-碳,-碳,苷元-碳和糖端基碳绝对构型都为R端基碳-碳-碳,14,苷元-碳,和,糖端基碳,绝对构型不同时，,端基碳和-碳的苷化位移值比苷元-位,无取代基者大约高3.5ppm单位。,端基碳,-碳,苷元-碳和糖端基碳绝对构型不同时，端基碳-碳,15,3、酯苷、酚苷的苷化位移规律：,苷化位移值较特殊,，端基碳与羰基碳（即苷元-碳）均向高场方向位移，-C向低场方向位移。,例如：齐墩果酸在成苷后，其分子结构中既含醇苷、也有酯苷结构。可用于对比有关碳原子化学位移值的变化情况。,3、酯苷、酚苷的苷化位移规律：,16,端基碳,端基碳,-C,-C,-C,-C,端基碳端基碳-C-C-C-C,17,-C,-C,-C,-C,-C-C-C-C,18,4、苷化位移有关说明：,苷化位移值与苷元的结构有关，,与糖的种类无关。,-D-葡萄吡喃甲苷,13,C,1,=104.0ppm,-D-甘露吡喃甲苷,13,C,1,=104.5ppm,4、苷化位移有关说明：-D-葡萄吡喃甲苷-D-甘露吡喃甲,19,如果苷元为链状结构，则糖端基碳的苷化,位移值随着苷元为伯、仲、叔基而递减。,例如：与糖的甲苷化学位移比较，苷元,分别为伯、仲、叔基时，糖端基碳的苷化,位移值的变化情况如下，,如果苷元为链状结构，则糖端基碳的苷化,20,端基碳化学位移值下降,-2,-4,-7,端基碳化学位移值下降-2-4-7,21,在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的-C的化学位移变化较大些，-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。,在确定了苷中糖的种类以后，将苷的,13,C谱,数据与相应单糖的,13,C谱数据进行比较，利用,苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。,在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的-C的化,22,例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置,将双糖苷的,13,C谱数据与相应单糖的,13,C谱 数据进行比较；,如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向,低场方向移动了（通常是47ppm),而与其,相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场,方向移动（约12ppm),则内侧糖的这个碳,原子就是糖的连接位置。,例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置,23,三、红外光谱IR,1.37003100cm,-1,间有明显O-H吸收峰。,2.如糖分子中含羧基、酰基等，则相应官能团,的IR吸收峰可见。,3.多糖在1500960cm,-1,有许多吸收峰，其中,970730cm,-1,间的峰可用作端基碳构型判断。,例如：840cm,-1,吸收峰 -L-吡喃糖苷,890cm,-1,吸收峰 -D-吡喃糖苷,三、红外光谱IR 1.37003100cm-1间有明显O-,24,四、质谱,1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发,性的衍生物才能进行质谱分析。,2、糖的立体异构体往往出现几乎相同的质谱，,仅在碎片丰度上稍有区别（,不能用质谱来区别,糖的构型！,）。,3、糖和苷的分子量：可用CI(化学电离),FD-MS,、FAB-MS等方法获得分子离子峰后测出。,四、质谱1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发,25,4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。,如果事先测定了多糖的组成，则可根据质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。,4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺,26,第六节 糖链的结构测定,主要解决四个问题,单糖的组成；,糖的氧环大小；,糖与糖之间的连接位置和顺序；,苷键构型。,第六节 糖链的结构测定 主要解决四个问题,27,（一）纯度测定方法,1、高压电泳法,原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、,在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合,物进行高压电泳。,电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。,缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。,电压：30-50V/cm,（一）纯度测定方法,28,时间：30-120min,显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。,注意：必须使用冷却系统，将温度维持在,0,以免烧坏支持体。,本法常用,2、超离心法,原理：由于微粒在离心力场中移动的速度,与微粒的密度、大小与形状有关，故将多糖,时间：30-120min,29,溶液进行,密度梯度超离心,时，如果是组成均一,的多糖，则应呈现单峰。,具体做法：,将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐,溶液，接着进行,密度梯度超离心，,待转速达到,恒定后（6000转/min），采用,间隔照明法,检测其是否为单峰。,溶液进行密度梯度超离心时，如果是组成均一,30,3、旋光光度法,在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10%,左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度,达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。,比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同,则为纯品，否则为混合物。,4、其他方法,如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。,3、旋光光度法,31,（二）分子量测定,1、测定多糖分子量物理方法：,沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。,2、,凝胶过滤法,简介：,在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积,成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分,子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的,分子量。,该法用量小、操作较简便。,（二）分子量测定,32,3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定,最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS,4、多糖分子量的测定方法,基质辅助激光解析电离质谱,（MALDI-MS）,基质辅助激光解析飞行时间质谱,(MALDI-TOF-MS).,3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定,33,（三）单糖的鉴定,1纸层析,展开系统：常用水饱和的有机溶剂,如：,正丁醇：醋酸：水,（4：1：5上层）BAW,正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW,展开方式：上行、下行等,显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后,引起的一些呈色反应。例如，,（三）单糖的鉴定,34,邻苯二甲酸苯胺,硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色）,三苯四氮唑盐试剂,（单糖和还原性低聚糖呈红色）,3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂,（酮糖呈红色）,过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显,兰底白斑,）。,邻苯二甲酸苯胺,35,2薄层层析,采用（硼酸液/无机盐）+硅胶 制板,吸附剂：硅胶,显色剂：,除纸层析应用以外，还有H,2,SO,4,/H,2,O或,乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、苯胺-二苯胺磷,酸试剂等。,2薄层层析,36,3气相层析,将糖制备成三甲基硅醚,醛糖用NaBH,4,还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。,4离子交换层析,原理：,糖的硼酸络合物可进行离子交换层析,3气相层析,37,优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液,进行分离（与气相比较）,需要仪器糖自动分析仪,5液相色谱,填充材料化学修饰的硅胶,优点：不必制备成衍生物。适合分析对热,不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。,缺点：灵敏度不及气相层析高。,优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液,38,多糖组成的鉴定,1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。,2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。,多糖组成的鉴定,39,（四）糖连接位置的测定,1、化学方法：多采用甲基化法,过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物,甲基化单糖,进行定性和定量分析。,甲基化过程：常用箱守法(Hakomori),水解过程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/L H,2,SO,4,或三氟乙酸水解。,（四）糖连接位置的测定,40,气相色谱法定性和