MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,人类MGMT基因（开启子）甲基化检测,(,MSP法,),试剂盒研发项目分享,主讲人：刘骏珲,技术支持：刘旭宏,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第1页,抑癌基因,它能够经过各种信号传导路径以及蛋白,-,蛋白之间相互影响起作用，影响细胞生长、分化、转移、粘连、增殖及细胞周期，促进凋亡，抑制肿瘤细胞转移和侵袭。,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第2页,MGMT基因开启子,1.与癌症相关,脑胶质癌,肠癌,口腔癌,肠癌,MGMT基因开启子发生甲基化,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第3页,研发思绪,MGMT甲基化检测试剂盒研发,引物筛选,引物性能评定,引物优化百分比确实定,初步检测体系建立,多原因优化设计,DNA质控体系建立，甲基化标准品合成,基因残留质控,转化成功质控,98%转化参考品构建,筛选合格样本,甲基化浓度梯度参考品,甲基化水平检出,检测流程建立,分析性能评定,检测体系建立,HANDS系统引入,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第4页,检测位点确定,经过文件调研确定MGMT基因开启子区域,甲基化CpG岛预测并与文件比较,A,CG,AA,CG,T,CG,AAA,CG,CAAAA,CG,TTCTAAAAA,CGCG,共7个潜在CpG位点,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第5页,MGMT甲基化标准品构建,1.确定目标序列，设计引物,2.重合延伸PCR制备DNA,3.菌液培养,4.浓度标定,5.测序验证,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第6页,DNA重亚硫酸盐转化体系确定,供给商选择,1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215),2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒,3.EZ DNA Methylation-GOLD Kit,转化程序选择,1.98C for 10 minutes,2.53C for 30 minutes,3.53C for 6 minutes OR,4.37C for 30 minutes,5.4C storage（3-4步 8循环）,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第7页,qPCR体系建立,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第8页,三大致系,G体系,针对人类基因组DNA设计,P（非甲基化）体系,依据转化后序列（非CpG位点设计探针）,L（甲基化）体系,覆盖CpG位点（全甲基化）长探针,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第9页,引物探针设计,HANDS,系统引入,1.,降低引物二聚体,2.,增加结合效率,3.,增加酶切活性,4.,保护碱基,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第10页,HANDS系统,5,3,5,3,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第11页,针对基因组DNA转化模板引物筛选试验,试验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，所以拟采取这对引物作为检测引物,F1R2,F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3R2;F3R3;F4R2,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第12页,淬灭探针,甲基化长探针,BHQ,FAM,BHQ,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第13页,针对基因组DNA转化模板探针以及引物HAND筛选试验,试验结果表明：,AT-,F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，所以拟采取这对引物作为检测引物,F1R2+PROBE1,AT-F1 AT-R2+PROBE1,F1R2+POBE2,AT-F1 AT-R2+POBE2,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第14页,反应体系优化,1.体系中Buffer，Mg,2+,引物浓度等优化。,2.添加剂优化：蔗糖，NH,4+,BSA,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第15页,针对基因组DNA转化模板检测体系添加剂体系筛选,试验结果表明：在反应体系中不添加任何添加剂对检测效果很好;,F1R2+PROBE2,F1R2+PROBE2+20um蔗糖,F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+,1R2+PROBE2+K+;F1R2+PROBE2+0.1%BSA,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第16页,分析性能评定,1.特异性考查,2.梯度标准品验证,3.反应体系稳定性,4.灵敏度考查,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第17页,针对试验室保留正常人类基因组DNA转化模板检测应用甲基化检测探针检测其特异性,结果表明，当前合成甲基化检测谈针对甲基化样品探针对于临床正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采取非甲基化探针能够检测信号。,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第18页,应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品,试验结果表明：当前体系针对不一样程度甲基化模拟模板，灵敏度为能够为检测到6copies/ul,400copies/ul,200copies/ul,100copies/ul,50copies/ul,25copies/ul,12copies/ul,6copies/ul,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第19页,针对基因组DNA转化模板检测体系少许临床样本检测,试验结果表明：当前体系能够对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT开启子检测，,只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第20页,针对基因组DNA转化模板检测体系,灵敏度深入考查,8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍,试验结果表明：针对基因组DNA转化模板检测体系，能够检测到转化液稀释512倍相当于基因组拷贝数12,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第21页,质量控制体系建立,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第22页,参考品构建,98,转化液构建,由,100,人类基因组转化液与人类基因组按百分比对参得到,1,：,1,甲基化参考品,由,100,人类基因组转化液与甲基化质粒标准品按百分比对参得到,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第23页,应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品,结果表明 梯度稀释质粒标准品稀释2*10,3,copies/ul在Ct值上与400ng转化人类基,因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1标准品,2*10,7,copies/ul-2*10,3,copies/ul,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第24页,应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯度参考品而且对临床正常样本转化液进行初步定量,试验结果表明：当前梯度稀释范围从2*10,10,copies/ul到2*10,3,copies/ul，临床正常样本转化液lCt值位于2*10,3,copies/ul之后，需要深入定量,2*10,10,copies/ul,2*10,9,copies/ul,2*10,8,copies/ul,2*10,7,copies/ul,2*10,6,copies/ul,2*10,5,copies/ul,2*10,3,copies/ul,临床正常样本转化液,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第25页,应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯度参考品而且对临床正常样本转化液进行深入定量,结果表明 梯度稀释质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1标准品（50%甲基化参考品）,2*10,3,copies/ul,400copies/ul,临床正常样本转化液,80 copies/ul,16 copies/ul,4 copies/ul,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第26页,甲基化灵敏度,采取,MGMT基因开启子50%甲基化参考品，按照百分比依次稀释,，依次构建,50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第27页,应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品对掺正常人类基因组转化液（按照400copies/ul-6copies/ul每一个浓度都加上正常人类基因组转化液）,试验结果表明：当前体系针对不一样程度甲基化模拟模板灵敏度为2.4%,以上浓度梯度均加入2.5ng正常人类基因组转化液组成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%）,参考品,400copies/ul,200copies/ul,100copies/ul,50copies/ul,25copies/ul,12copies/ul,6copies/ul,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第28页,整体效果,质粒梯度不惨正常人类基因组转化液,质粒梯度对掺惨正常人类基因组转化液,只加正常人类基因,组转化液,NTC,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第29页,THANK YOU,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第30页,完全转化且位点完全甲基化,甲基化长探针,M,非甲基化探针,P,MGMT甲基化试剂盒研发专家讲座,第31页,