任务五高效液相色谱仪的使用详解课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,仪器分析,课程,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,仪器分析,生物工程系,仪器分析生物工程系,任务五,高效液相色谱仪的使用,任务五 高效液相色谱仪的使用,了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围,了解高效液相色谱仪的构造,掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法,学 习 目 标,了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围 学,一、概 述,高效液相色谱法（,HPLC,）：以气相色谱为基础，在经典液相色谱（,LC,）实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。,（一）,HPLC,的特点,（二）,与经典,LC,相比,HPLC,的优点,（三）,HPLC,的适用范围,一、概 述 高效液相色谱法（HPLC）：以气相,高压,压力可达,150,300kg/m,2,；,高速,流速为,0.1,10.0mL/min,；,高效,柱效高，在一根柱中同时分离成分可达,100,种；,高灵敏度,紫外检测器可达,0.01ng,，荧光和电化学检测器可达,0.1pg,。,（一）,HPLC,的特点,高压压力可达150 300kg/m2；（一）HPLC,（二）,与经典,LC,相比,HPLC,的优点,速度快,通常,15,30min,一个样，某些样品,5min,可完成；,分辨率高,可选择固定相和流动相达到最佳分离效果；,灵敏度高,紫外检测器可达,0.01ng,，荧光和电化学检测器可达,0.1pg,；,柱子可反复使用,用一根色谱柱可分离不同的化合物；,样品量少，容易回收,样品经过色谱柱后不被破坏。,（二）与经典LC相比HPLC的优点 速度快通常1530,（三）,HPLC,的适用范围,适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品；,应用范围广泛，适用于医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等多个领域；,在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占,70,80%,。,（三）HPLC的适用范围 适合分析高沸点、热不稳定、离子型的,一,二、结 构,一二、结 构,（一）工作流程,高压输液系统,色谱柱系统,（数据记录处理系统）工作站,检测系统,进样系统,动画,（一）工作流程高压输液系统 色谱柱系统（数据记录处理系统）工,（二）工作系统,1,、高压输液系统,主要部件：贮液器、过滤器、,高压输液泵、梯度淋洗装置,（二）工作系统1、高压输液系统,（二）工作系统,2,、进样系统,流路中为高压力工,作状态，通常使用耐高,压的六通阀进样装置。,动画,（二）工作系统2、进样系统动画,（二）工作系统,3,、色谱柱系统,柱体为直型不锈钢管，内径16,mm，,柱长540,cm。,发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,（二）工作系统3、色谱柱系统,（二）工作系统,4,、检测器系统,紫外检测器,荧光检测器,示差折光检测器,光电二极管阵列检测器,（二）工作系统4、检测器系统,（二）工作系统,5,、色谱工作站,以,VI2010,色谱工作站（,软件操作示范,）为例：此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子设备连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。,（二）工作系统5、色谱工作站,三、使 用 技 术,准 备,清洗、关机,冲洗柱子冲洗管路关主机,关电脑,关电源,开机、进样,流动相,标液,样液,柱子选择,仪器检查,开电脑、主机、工作站,参数设置,方法建立,进样,操 作 步 骤,三、使 用 技 术准 备 清洗、关机冲洗柱子冲洗管路,1,、准备所需的流动相，用合适的,0.45m,滤膜,过滤，超声脱气,20min,。,2,、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。,3,、准备样品和标准溶液，用,合适的,0.45,m,滤膜过滤。,4,、检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管道是否连接正常。,准 备,1、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气,接通电源，依次开启,不间断电源,、,真空脱气机,、,多元泵、检测器,。,待泵和检测器自检结束后，打开,电脑显示器,，,主机,、最后打开,色谱工作站,。,1,、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。,2,、更换流动相并排气泡。,3,、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观察压力值变化、观察基线变化。,4,、进样：自动进样、手动进样。,开机、进样,接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、多元泵、检,1,、分析结束，数据处理、打印报告。,2,、关闭,柱温箱,和,检测器,，然后再用经过滤和脱气的适当,溶剂冲洗,色谱系统,。,3,、冲洗完毕后，,逐步降低流速,至,0,，,关泵,。,4,、关闭,液相装置,，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。,清洗、关机,1、分析结束，数据处理、打印报告。清洗、关机,四、数 据 分 析,（一）谱图判断,（二）结果分析,四、数 据 分 析（一）谱图判断,（一）谱图判断,分离度,一般应,1,.5,；,重复性,两次谱图的峰面积应相差不超过,1%,；,理论塔板数,应,规定的理论塔板数目；,拖尾因子,0.95,T,1.05,；,保留时间,对照与样品的主成分保留时间应大致一致。,（一）谱图判断 分离度一般应1.5；,（二）结果分析,1,、定性方法,利用已知标准品定性,利用检测器的选择性定性,利用紫外检测器全波长扫描功能定性,2,、定量方法,归一化法,外标法,内标法,（二）结果分析1、定性方法,课后思考题,1,、外标法定量与内标法定量有何差别？,2,、流动相在使用前为何要经过脱气处理？,课后思考题1、外标法定量与内标法定量有何差别？,实训六,高效液相色谱仪的使用,一、实训目的,二、实训原理,三、实训材料,四、实训步骤,五、结果分析,六、注意事项,实训六 高效液相色谱仪的使用一、实训目的,一、实 训 目 的,1,、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；,2,、掌握高效液相色谱仪的使用方法；,3,、学会用单点外标法进行数据处理和结果分析。,一、实 训 目 的1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；,二、实 训 原 理,利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱中后，组分就在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各种组分的吸附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序进入色谱柱，产生的离子流信号经放大，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。,二、实 训 原 理 利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液,三、实 训 材 料,1,、主要仪器设备：,Agilent,高效液相色谱仪，,Hypersil ODS-C,18,柱（,5,m,，,4.6*100mm,），,MWD,检测器，超声波清洗器，膜过滤装置。,2,、主要试剂：甲醇（色谱纯），,0.02mol/L,乙酸铵溶液，,25g/mL,苯甲酸标准溶液。,3,、样品测试溶液：市售碳酸饮料。,所用溶液均经过,0.45,m,膜过滤。,三、实 训 材 料1、主要仪器设备：Agilent高效液相色,四、实 训 步 骤,1,、取市售碳酸饮料约,10mL,于,50mL,烧杯中，超声脱气,30min,后，准确吸取,1mL,，经滤膜过滤至,10mL,比色管，以经滤膜过滤的高纯水定容至,5mL,。,2,、色谱条件：柱温,25,；检测波长,230nm,；,进样量,20,L,；,流速,1.0mL/min,；,流动相 甲醇：乙酸铵溶液,=5:95,四、实 训 步 骤1、取市售碳酸饮料约10mL于50mL烧杯,四、实 训 步 骤,3,、开机，打开色谱工作站。,4,、打开脱气阀，以,5mL/min,流速对流动相进行脱气。,5,、脱气完毕后，调节流动相流量为,1.0mL/min,，切换脱气阀，打开柱温控制开关，打开,UV,检测器开关。按色谱条件设置相应参数。,6,、建立方法和进样序列。,四、实 训 步 骤3、开机，打开色谱工作站。,四、实 训 步 骤,7,、待基线平稳后，调用方法和序列，开始测样。,8,、测样结束，打印图谱报告。,9,、关闭检测器和柱温箱，清洗色谱柱及管路，以,1.0mL/min,的流速，先以水清洗色谱柱,20min,，再以甲醇清洗色谱柱,30min,。,10,、关闭色谱工作站、关机，作好使用记录。,四、实 训 步 骤7、待基线平稳后，调用方法和序列，开始测样,五、结 果 分 析,1,、定性分析,以保留时间定性，填写下列表格。,标准样品名称,苯甲酸,保留时间（,min,）,标准图谱中标准样品浓度（,g/mL,）,25.0,判断样品中有无苯甲酸（打勾）,A,有,B,无,五、结 果 分 析1、定性分析标准样品名称苯甲酸保留时间（m,五、结 果 分 析,2,、定量分析,以峰面积定量，根据公式计算样品中苯甲酸的含量。,W,样品中苯甲酸的含量，,g/mL,；,A,样品中被测物质的峰面积；,As,标准样品中被测物质的峰面积；,C,标准样品的浓度，,g/mL,；,V,2,样液定容体积，,mL,；,V,1,所取样液体积。,五、结 果 分 析2、定量分析,六、注 意 事 项,1,、流动相必须使用色谱纯试剂，使用前用,0.45,m,膜或更细的膜过滤，并超声,脱气,，恢复到,室温,后使用。,2,、不能用纯乙腈作流动相，防止单向阀粘住导致泵不进液。,3,、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存，应该用,有机相（如甲醇等）,保存。,4,、,C18,柱绝对不能进,蛋白样品,、,血样,、,生物样品,。,六、注 意 事 项1、流动相必须使用色谱纯试剂，使用前用0.,六、注 意 事 项,5,、注意柱子的,pH,值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。,6,、更换流动相时，应先将吸滤头部分放入烧杯中，边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶相的流动相时要用异丙醇过滤一下。,7,、气泡会致使压力不稳，重现性差，在使用过程中尽量,避免产生气泡。,六、注 意 事 项5、注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱,实训技能考核标准,项目,考核内容,考核重点,分值比例,高,效,液,相,色,谱,仪,的,使,用,样,品,处,理,样品移取,吸量管的正确使用；达到熟练程度,5%,脱气处理及定容,超声波仪的正确使用能够精密移取，达到熟练程度。,5%,滤膜过滤,注射器的正确使用；微孔滤膜器的正确使用；熟练操作。,5%,上机测量,能够正确仪器操作，包括开关机、设置参数、建立方法、测量；操作熟练安全。,50%,结果分析,原始记录及时规范整洁；有效数字准确；定性分析正确；计算准确。,30%,其他操作,按规定着装、能够正确进行标识、注意操作文明；注意操作安全。,5%,合计,100%,实训技能考核标准项目考核内容考核重点分值比例高样样品移取,