RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子的表达课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA,干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子的表达,蔡可丽,山东大学齐鲁医院,RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子的表达 蔡,1,概述,视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,传统的治疗方法包括眼球摘除术、光凝治疗、冷冻治疗、外放射治疗、表层巩膜敷贴器、光动力疗法、温热治疗、经瞳孔温热疗法、化疗热疗法等，但上述各种方法均有其各自不足之处,概述视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）是,2,概述,血管生成在肿瘤形成中是关键（血管生成开关）,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对内皮细胞的分裂和迁移具有激活作用并引起血管生成，是重要的血管生长因子,siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA，可介导其降解,概述血管生成在肿瘤形成中是关键（血管生成开关）,3,研究目的,本研究利用RNA干扰技术，探讨VEGF编码基因的siRNA对人RB细胞的影响,研究目的 本研究利用RNA干扰技术，探讨VEGF编,4,主要内容,RB细胞进行传代培养,VEGF特异性的siRNA转染入RB细胞,RT-PCR检测RB细胞VEGF mRNA的表达,Western-blot法检测RB细胞VEGF蛋白表达,MTT法检测VEGF特异性siRNA对RB细胞生长的影响,主要内容RB细胞进行传代培养,5,材料与方法,细胞培养,RB细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37，5%CO2 培养箱中常规孵育，每23天换液传代，取对数生长期的细胞用于实验,材料与方法细胞培养,6,分为正常对照组(只加脂质体)、阴性对照组(脂质体+阴性siRNA oligo)和siRNA转染组(脂质体+VEGF特异性siRNA oligo)三组,采用LipofectamineTM 2000脂质体转染法转染,实验分组及转染,材料与方法,分为正常对照组(只加脂质体)、阴性对照组(脂质体+阴性si,7,RT-PCR法检测RB细胞VEGF mRNA的表达,1.PCR引物设计及合成：,根据人类基因库(NCBI，GENERANK)中VEGF基因和-MG的mRNA序列，应用在线引物设计软件Priemr3设计包含目的基因位点的引物。引物序列为：,VEGF基因引物序列：正义链5-ACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3,反义链5-ACGCGAGTCTGTGTTTTTGC-3,扩增片断长度大约433bp,-MG基因作为内参：正义链5-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3,反义链5-ACCCCCACTGAAAA AGATGA-3,扩增片断长度大约330bp,材料与方法,RT-PCR法检测RB细胞VEGF mRNA的表达1.PC,8,2.按Trizol RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA,3.第一链合成反应试剂盒（MBI）进行逆转录反应,4.PCR扩增,5.扩增产物进行VEGF和-MG条带吸光度的定量分析，两者比值作为VEGF的半定量值,材料与方法,2.按Trizol RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA材,9,收集RB细胞，提取总蛋白,，,测定蛋白含量,SDS-PAGE凝胶电泳,转膜、封闭、免疫杂交,洗膜、孵育、显影,Western-blot法检测RB细胞血管内皮生长因子蛋白表达,材料与方法,MTT法检测VEGF特异性siRNA对RB细胞生长的影响,收集RB细胞，提取总蛋白，测定蛋白含量 Western-b,10,采用SPSS 11.0 统计包进行统计处理，计量资料以s 表示，采用t 检验，P 0.05 为差异有统计学意义。,统计学处理,采用SPSS 11.0 统计包进行统计处,11,结果,RB细胞呈圆形，体积小，胞浆少，核大，核分裂可见,RB细胞体外培养,结果RB细胞呈圆形，体积小，胞浆少，核大，核分裂可见 RB细,12,结果,绿色荧光FAM标记的siRNA转染RB细胞后，转染成功的RB细胞有绿色荧光分布,siRNA转染视网膜母细胞瘤细胞,结果绿色荧光FAM标记的siRNA转染RB细胞后，转染成功的,13,结果,1：siRNA转染组；2：正常对照组；3：阴性对照组,RT-PCR检测RB细胞血管内皮生长因子mRNA的表达,结果1：siRNA转染组；2：正常对照组；3：阴性对照组,14,结果,N1：正常对照组；N2阴性对照组；siRNA：siRNA转染组,Western-blot法检测RB细胞血管内皮生长因子蛋白表达,结果N1：正常对照组；N2阴性对照组；siRNA：siRNA,15,结果,MTT法检测VEGF特异性siRNA对RB细胞生长的影响,结果MTT法检测VEGF特异性siRNA对RB细胞生长的影响,16,上世纪70年代初Folkman等提出“肿瘤的生长依赖血管生成，抗血管生成治疗可能为有效治疗措施”的观点以来，有关肿瘤血管生成机制和抗血管治疗的研究逐渐成为肿瘤学领域研究的热点,抗肿瘤血管生成基因治疗是将能够抑制新生血管生成的基因导入肿瘤或其周围组织内，通过抑制新生血管生成基因的表达，使肿瘤组织在较长期内处于相对缺血的微环境中，从而达到治疗肿瘤的目的,视网膜母细胞瘤的抗血管生成基因治疗,讨论,上世纪70年代初Folkman等提出“肿瘤的生长依赖血管生成,17,肿瘤细胞通过分泌多种血管生成调控因子促进血管生成，其中VEGF被证明是目前所知作用最强、特异性最高、最有效的促血管生成因子,VEGF的主要功能是:促进血管内皮细胞增殖;提高血管的通透性，诱导新生血管的形成促进肿瘤细胞向淋巴结转移等,肿瘤细胞不仅分泌VEGF，同时还能表达VEGF受体，VEGF能直接刺激肿瘤细胞的增殖，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。由于VEGF的作用，血管内皮及其前体细胞渗入活性血管生成部位参与血管的形成，并对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移等发挥重要作用,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体与肿瘤之间的关系,讨论,肿瘤细胞通过分泌多种血管生成调控因子促进血管生成，其中VEG,18,RNAi 属于转录后水平的基因沉默(PTGS)机制，迄今为止的研究认为RNAi 对染色体DNA 序列的复制和转录过程不产生任何影响,具有高度的序列特异性，即使siRNA中只有一个碱基与靶序列错配，就会失去干涉效应,具有抑制基因表达的高效性,可以在不同细胞间长距离传递和维持,RNA干扰的特征,讨论,RNAi 属于转录后水平的基因沉默(PTGS)机制，迄今为止,19,已被用为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，在基因功能和基因治疗研究中发挥了重要作用,已被众多学者认可为目前进行基因治疗研究的最有效的手段之一,RNA干扰的应用,讨论,已被用为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，在基因功能和,20,体内siRNA转染效率较低，同时siRNA导入问题上同样也面临着技术上的困难,siRNA在体内稳定性差，作用时间短,在mRNA内，不同位点的siRNA具有不同的诱导RNAi的效率，能有效诱导RNAi的位点有限,RNA干扰的局限性,讨论,体内siRNA转染效率较低，同时siRNA导入问题上同样也面,21,展望,由于眼是一个相对独立的器官，局部用药的可能性要远远大于全身其他部位的肿瘤。我们下一步的工作计划将VEGF特异性siRNA对视网膜母细胞瘤细胞进行稳定转染，并进行体内动物实验，客观评价RNA干扰技术对血管密度的影响。,因此，RNA干扰技术有望成为视网膜母细胞离治疗的新突破，为新型抗癌药物开发提供新思路。,展望 由于眼是一个相对独立的器官，局部用,22,结论,VEGF特异性siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞后能够特异性的沉默VEGF基因表达,RNA干扰技术在未来的视网膜母细胞瘤基因治疗的研究方面非常具有应用价值,VEGF基因能够作为视网膜母细胞瘤基因治疗的有效靶点,结论VEGF特异性siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞后能够特,23,Thank you,Thank you,24,