血液学检验15第三章-第4节-血细胞培养技术课件

标题（黑体36号）,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四节 血细胞培养技术,第一章 造血及造血调控,第一节 造血器官与造血微环境,临床血液学检验技术,重庆医科大学陈婷梅,第三章 造血检验技术,第四节 血细胞培养技术,第一章 造血及造血调控第一节 造血器官与造血微环境临床血液学,目 录,一、细胞培养设备和器材,二、培养基,三、细胞培养技术,四、常用血细胞培养技术,目 录一、细胞培养设备和器材,重点提示,细胞系与细胞株的区别,常见白血病细胞系的传代培养方法，原代白血病细胞分离培养方法。,造血祖细胞的培养包括的试验方法，各种方法的简要临床意义。,造血干细胞检测的主要实验方法。,重点提示细胞系与细胞株的区别,一、细胞培养设备和器材,基本设施设备,无菌间 超净工作台,培养箱 倒置显微镜,离心机 电热干燥箱,冰箱 过滤除菌装置,高压灭菌器 水纯化装置,生物液氮储存器,一、细胞培养设备和器材基本设施设备,细胞培养室,超净工作台,一、细胞培养设备和器材,细胞培养室超净工作台一、细胞培养设备和器材,二氧化碳培养箱,倒置显微镜,一、细胞培养设备和器材,二氧化碳培养箱倒置显微镜一、细胞培养设备和器材,压力蒸汽消毒器,液氮储存罐,一、细胞培养设备和器材,压力蒸汽消毒器液氮储存罐一、细胞培养设备和器材,常用器材,细胞培养器皿 液体储存瓶,移液管和吸管 移液器,离心管以及量筒 漏斗,烧杯 注射器,一、细胞培养设备和器材,常用器材一、细胞培养设备和器材,一、细胞培养设备和器材,一、细胞培养设备和器材,二、培养器皿的清洗和消毒,玻璃器皿的清洗,浸泡：,使用的玻璃器皿清水浸泡，新的玻璃器皿使用前用自来水刷洗后稀盐酸浸泡过夜。,刷洗：,清水浸泡后用毛刷蘸取洗涤剂刷洗。,浸酸：,酸液由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水三者按比例混合而成，器皿应完全浸泡于酸液中，浸泡过夜。注意酸液具有腐蚀性。,冲洗：,用自来水至少10次，尽量不留残迹，再用蒸馏水清洗3-5 次。,二、培养器皿的清洗和消毒玻璃器皿的清洗,橡胶制品的清洗,用过的瓶塞先自来水冲洗，再用1%稀HCl浸泡30分钟，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，晾干备用。,新瓶塞应先自来水冲洗，用2%NaOH 或洗衣粉煮10-20分钟，自来水冲洗后，再用5%稀HCl浸泡30分钟，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，晾干备用。,二、培养器皿的清洗和消毒,橡胶制品的清洗 二、培养器皿的清洗和消毒,塑料制品的清洗,现多采用无毒并经特殊处理的塑料制品，为一次性物品，开包装即用。,必要时可用自来水冲洗数次，2%NaOH 浸泡过，用自来水充分冲洗，再用5%HCl浸泡30min，最后自来水、蒸馏水冲洗后，晾干消毒灭菌备用。,二、培养器皿的清洗和消毒,塑料制品的清洗 二、培养器皿的清洗和消毒,培养器皿的消毒灭菌,紫外线消毒：,通过紫外线对微生物的辐射损伤和破坏核酸的功能使微生物致死，可用于无菌间、超净工作台操作台面、细胞培养板的消毒。,高温湿热消毒：,高温高压蒸汽灭菌、煮沸消毒，高压蒸气灭菌是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法，主要用于金属器械、玻璃器皿、布类、PBS、Hanks液等。,二、培养器皿的清洗和消毒,培养器皿的消毒灭菌二、培养器皿的清洗和消毒,化学消毒法：,利用化学消毒剂杀灭病原微生物的方法，最常见的消毒剂为75%酒精及1的苯扎溴铵，前者主要用于皮肤，物品表面及无菌室内的壁面处理，后者则主要用于器械的浸泡。,生物消毒法：,生物消毒法也叫抗生素杀菌法，是按照一定浓度比例将抗生素加入培养基及相关试剂中，主要用于培养基及相关试剂的消毒和污染预防。,二、培养器皿的清洗和消毒,化学消毒法：利用化学消毒剂杀灭病原微,三、培养基,培养基是供细胞体外生存、生长的基本溶液。,培养基种类繁多,按其状态可分为固体、半固体和液体培养基,根据成分来源可分为天然培养基和合成培养基。,三、培养基培养基是供细胞体外生存、生长的基本溶液。,天然培养基,指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液、鸡胚浸出液等。,血清（serum）,是最重要和常见的天然培养基，可取自人和多种动物，如马、牛、羊、鸡等，其中使用最广泛的是牛血清，分为小牛血清（calf serum）、新生牛血清（new born serum）、胎牛血清（fetal bovine serum），胎牛血清品质最高。,三、培养基,天然培养基三、培养基,合成培养基,合成培养基是通过人工设计而成的培养基，基本组分包括氨基酸、维生素、糖类（一般是葡萄糖）、无机盐离子和其他一些附加成分。,MEM（Eagles Minimal Essential Medium),DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium）,IMDM（Iscoves modified Eagle medium）,RPMI1640,合成培养基称为基本培养基或通用培养基，而添加了一定比例的血清后称为完全培养基。,三、培养基,合成培养基 三、培养基,四、细胞培养技术,原代培养：,从供体获取细胞后的首次培养，分离组织，剪碎、机械分散或酶解松散组织，获得的细胞或组织块接种于培养瓶。,传代培养：,体外培养细胞不断分裂，细胞发生接触抑制而生长减慢，培养基也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长，就需要将培养细胞分离稀释后，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内进行培养。这个过程也叫再培养（subculture）。,四、细胞培养技术原代培养：从供体获取细胞后的首次培养，分离组,细胞系（cell line）：,是由原代培养经过初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，即这个细胞群体含有不同的表型,。,细胞株（cell strain）：,细胞系经过克隆培养、物理细胞分离或其他选择技术分离得到单一细胞组成的细胞谱系。,四、细胞培养技术,细胞系（cell line）：是由原代培养经过初步纯化，获,细胞冻存：,选择状态较好的细胞进行冻存，1000r/min，5分钟，弃掉上清；将准备好的冻存液逐滴加入离心管中，边加边振荡，混匀后的液体吸入冻存管，封口胶密封；,将冻存管置于4放置30分钟45分钟，置-20过夜。第二天将其转移至-80或液氮罐中的细胞保存盒中。,四、细胞培养技术,细胞冻存：四、细胞培养技术,细胞复苏：,从-80或液氮罐中取出冻存管后，迅速浸入37水浴箱中快速摇动，至冰块完全融化。,用酒精绵球擦拭冻存管外部，将其中的细胞悬液加入离心管，缓慢加入4ml培养液，离心，1000r/min,10分钟，弃上清。用培养液重悬细胞，将细胞接种于培养瓶，放入培养箱培养。,四、细胞培养技术,细胞复苏：四、细胞培养技术,五、常用血细胞培养技术,原代白血病细胞分离培养,经骨髓穿刺术采集骨髓液23ml，将肝素抗凝的骨髓液滴加在Ficoll-Hypaque分离液上，2000 r/min，15分钟；,吸管吸取中间的单个核细胞层，转移至另一干燥离心管中，PBS 液洗涤三次，调整原代白血病细胞浓度（25）10,6,个/ml，将其接种于培养瓶中进行培养。,五、常用血细胞培养技术原代白血病细胞分离培养,K562白血病细胞系的传代培养,K562细胞系是人红白血病细胞系，是从一慢性髓系白血病（急变期）患者的骨髓组织中分离建系，在一些抗癌药物及化学物质的作用下，可向红系、粒系、单核系、巨核系细胞分化。,五、常用血细胞培养技术,K562白血病细胞系的传代培养五、常用血细胞培养技术,操作：,取长满细胞的培养瓶，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞从瓶壁脱落，将细胞悬液转入离心管，离心1000 r/min，10分钟，弃上清液。,加入适量新鲜的含10%小牛血清的完全RPMI1640培养基，吹打混匀后，按细胞密度110,5,/ml，将细胞接种至新的培养瓶中进行培养。,五、常用血细胞培养技术,操作：五、常用血细胞培养技术,骨髓造血干/祖细胞培养,是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体取出的造血祖细胞，使之生存、增殖和分化。,红系祖细胞的培养,粒-单系祖细胞培养,巨核系祖细胞培养,混合祖细胞培养,五、常用血细胞培养技术,骨髓造血干/祖细胞培养五、常用血细胞培养技术,造血祖细胞体外培养的意义,研究造血细胞分化、成熟及其调节机制；,研究各种细胞因子对造血调节的作用机制；,造血细胞与非造血细胞之间作用及调控的分子机制；,研究药物对骨髓造血的影响；,研究造血系统疾病的发生机制、诊断和治疗效果分析。,五、常用血细胞培养技术,造血祖细胞体外培养的意义 五、常用血细胞培养技术,红系祖细胞的培养,在培养体系中以甲基纤维素为支持物，在适量EPO等因子刺激下，使骨髓中造血干/祖细胞形成BFU-E 和CFU-E。,五、常用血细胞培养技术,红系祖细胞的培养五、常用血细胞培养技术,粒-单系祖细胞培养,体外经过分离获得的单个造血干/祖细胞，在造血生长因子作用下，在半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落，称为粒-单系集落形成单位（CFU-GM）。,五、常用血细胞培养技术,粒-单系祖细胞培养五、常用血细胞培养技术,巨核系祖细胞培养,巨核系造血祖细胞（CFU-Meg，BFU-Meg）包括幼稚巨核系祖细胞的爆式集落形成单位（BFU-MK）和成熟巨核系祖细胞的集落形成单位（CFU-MK）。,五、常用血细胞培养技术,巨核系祖细胞培养五、常用血细胞培养技术,混合祖细胞培养,混合祖细胞集落（CFU-Mix）中含有红细胞、粒细胞、单核细胞以及巨核细胞等两系、三系和四系的混合。,五、常用血细胞培养技术,混合祖细胞培养五、常用血细胞培养技术,造血干细胞培养,体内重建实验,脾集落形成单位测定法,长期重建实验和骨髓重建实验,竞争性再植实验,体外克隆形成实验,LTC-IC，ELTC-IC,高增殖潜能集落形成细胞实验,原始集落形成单位实验,五、常用血细胞培养技术,造血干细胞培养五、常用血细胞培养技术,造血细胞培养主要包括CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-MK、CFU-Mix、CFU-GEMM及白血病细胞系（株）的培养，在某些贫血、骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生异常综合征及白血病的诊断及预后评估中有一定意义，也可用于血液病发病机制、白血病细胞生物学等多方面的实验研究。,第三章第四节 小结,造血细胞培养主要包括CFU-E、BFU,血液学检验15第三章-第4节-血细胞培养技术课件,