生物基因组序列比对分析专家讲座

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,WWW.Ggene.Cn,*,生物基因组序列比对分析，分子进化,兔肝DNA提取与二苯胺显色法测定DNA含量,目标基因SNP位点判定及其意义,综合性设计性试验-5,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第1页,此试验共包含以下三个部分,第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化,第二部分：兔肝DNA提取和测定,第三部分：目标基因SNP位点判定及其意义,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第2页,第一部分：生物基因组序列比对分析、分子进化,全基因组序列数据积累,使得不一样生物之间进化关系能够从分子水平上进行研究。不一样于以往单纯依赖于生物形态学特征,这种分析愈加深刻愈加本质。利用分子序列使得我们能够研究,从单细胞生物到植物、动物甚至人进化关系。,比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知基因和基因组结构进行比较，来了解基因功效、表示机理和物种进化学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码次序上和结构上同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功效和疾病分子机制，说明物种进化关系，及基因组内在结构。当前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组普通比较小，但编码基因百分比较高，重复次序和非编码次序较少；其GC%比较高；内含子和外显子结构组织比较保守，剪切位点在各种生物中一致。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第3页,比较作图就是利用共同遗传标识（主要是分子标识、基因cDNA克隆以及基因组克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标识在不一样物种基因组中分布情况，提醒染色体或染色体片段上同线性（synteny）或共线性（collinearity），从而对不一样物种基因组结构及基因组进化历程进行准确分析。基因组比较作图研究，不但提醒了同属甚至同科物种基因组间同源性和差异性，对不一样物种在起源、演化过程中改变研究含有巨大启示作用。,比较作图研究意义在于：一、依据不一样种基因组基因及其排列次序高度保守特点绘制而成比较图，能够研究和探明它们进化线索。广泛比较作图可为多个种所用，建立它们之间联络框架或系统。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第4页,基因组比对软件,Mauve,http:/genome.lbl.gov/vista/index.shtml,VISTA,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第5页,一个最基本假设是地球上全部物种都有一个共同祖先，从这个祖先开始以数状形式发展，通常称为生命之树（tree of life）。,分子进化研究目标：经过序列同源性比较，分析序列间改变进而了解基因进化以及生物系统发生内在规律。,分子进化有两个主要研究对象，以全基因组序列为研究对象分析物种进化；以某基因在多个物种同源序列为研究对象分析基因进化,分子进化,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第6页,末端,物种,中间枝条,根,末端分支,节点,理论上，一个DNA序列在物种形成或基因复制时，分裂成两个子序列，所以系统发育树普通是二歧；,假如是一棵有根树，则树根代表在进化历史上是最早、而且与其它全部分类单元都有联络分类单元，反应时间次序；,假如找不到能够作为树根单元，则系统发生树是无根树，反应距离；,从根节点出发到任何一个节点路径指明进化时间或者进化距离。,系统发生树性质：,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第7页,基因分子进化分析步骤,（1）以目标基因为种子序列，搜索其在其它物种中同源序列,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第8页,（2）将上述同源基因核酸或蛋白序列作序列比对，,Clustal X,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第9页,（3）构建系统发生树：MEGA，PHYLIP，PAUP,http:/ g 加,8ml 1X SSC,1X SSC洗,两次,取8ml匀浆液,离 心,匀浆、过滤,2.弃上清留,沉淀,加至8ml,1X SSC,离 心,加至 8ml 0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA,离 心,3.弃上清留沉淀,（脱氧核糖核蛋白）,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第14页,加约2倍,体积,95%乙醇,沉淀,加 0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA至4ml,搅拌10min,逐滴加入0.5ml,15%SDS,加1ml,5M NaCl,去塞！离心,加塞重复,倒置抽提,10min,吸收上清液,勿吸到中间层！,等体积氯仿-异丙醇混合液,DNA析出,用玻棒挑出,挑取DNA至一离,心管(小烧杯)用10ml,0.01N NaOH溶解,重复,一次,轻搅,10min,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第15页,注意事项,尽可能防止DNA断裂,1.匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短；,2.试验中使用吸收DNA水溶液滴管口应粗短并成钝口。,保持DNA活性，防止酸碱或其它变性原因使DNA变性。,搅动不要太大，以免使DNA断裂。,整个试验过程应在低温条件下进行。,搅拌时动作要轻，重复倒置抽提，不可激烈振荡。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第16页,加入15%SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。,SDS温度不能太低，易凝固。吸过SDS吸管要及时清洗。,加入CHCl,3,/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸收无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。,CHCl,3,/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗洁净。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第17页,离心机使用,打开电源开关；,平衡放置离心管；盖上盖子。,调整时间旋钮至10min；,迟缓调整速度旋钮至9档，每5-10s上升1档；,离心完成后机器自动停顿，待完全停顿后，打开盖子取出离心管。,离心管必须平衡后，才能开启离心机；,离心机盖子必须盖紧；,离心过程中不要用重物撞击离心机；,要等离心机完全停顿转动后再打开盖子。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第18页,二苯胺显色法测定DNA含量,DNA-,脱氧核糖在酸性条件下转变成-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。,每ml含20400,g范围内光密度与DNA浓度成正比。反应液中加入少许乙醛，可提升反应灵敏度。,试验原理,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第19页,取8支试管，按试验指导表格加入试剂。,加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。,以光密度为纵坐标，DNA含量（g/ml）为横坐标，绘制标准曲线.,将试验中所得到兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和“B”，按表加入试剂。,混匀，置沸水中10min,取出冷却。,在595nm处，以B管调零，测得待测液光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度值DNA含量。,试验操作,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第20页,核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在260nm处有最大吸收，测A260/A280可得知核酸大致纯度。,A260/A280,1.8 表示DNA纯,1.8 RNA含量高,1.8 蛋白含量高,核酸紫外吸收光谱测定,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第21页,双波长分光光度计，该种机采取两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行分析，钨丝灯发出光适宜范围在3601000nm，氘灯发出光适宜范围在150400nm。经过两种光源切换，能够在两种波长范围内使用。,使用石英杯作为比色杯。,岛津UV-120分光光度计,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第22页,打开电源，指示灯亮，调至UV，打开样品室盖,打开氘灯（向下按至Heat几秒后扳至ON）,预热10min,调整波长、灵敏度,旋扭调至“0-100%T”，放入空白管与样品，调0%T,盖上盖子，旋扭调至“ABS 0-2”，调0%A,拉出样品，读数。开盖，统计。,岛津UV-120使用方法,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第23页,以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波优点测定样品液吸光度，求出样品液A,260,/A,280,比值和DNA浓度。,试验操作,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第24页,第三部分：目标基因SNP位点判定及其意义,SNP(single nucleotide polymophism)即单核苷酸多态，是指群体中变异频率大于1%单个核苷酸改变而造成核酸序列多态，包含置换、颠换、缺失和插入。,普通来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，所以又叫双等位基因。SNP在人基因组中发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。,C C,A,T T G A C.,G G,T,A A C T G.,C C,G,T T G A C.,G G,C,A A C T G.,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第25页,SNP对基因功效影响,依据在基因中位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP,cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP,rSNP)。其中cSNP依据是否改变编码氨基酸又可分为同义cSNP(synonymous cSNP)和非同义cSNP(non-synonymous cSNP)。,非同义cSNP：，蛋白激酶,PRKCH,基因内一个非同义cSNP(1425G/A)，等位位点从G到A 改变可造成激酶活力增强，进而激活其信号通路，使患脑梗塞风险增加。,同义cSNP：多向性耐药基因1(,MDR1,)第3435 位一个同义SNP(3435C/T)可改变,MDR1,基因产物功效。这种机制不是经过改变mRNA 及蛋白产量水平，而是经过改变mRNA 构象、蛋白折叠及细胞定位，进而影响基因功效发挥。,内含子区SNP：葡萄糖激酶调整蛋白(,GCKR,)基因第16 号内含子中一个SNP(rs780094,T/C)，相比C等位位点，含T等位位点时，个体表现为葡萄糖水平较低、胰岛素耐受较少，患2型糖尿病风险较低。,调控区rSNP：IFN-,基因开启子区含一个rSNP(-764G/C)，相比C 等位位点，含G 等位位点时，IFN-g 基因开启子与转录因子结合增强，开启子活力提升到23倍。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第26页,目标基因SNP查询,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第27页,输入基因名称与物种名称，,如 NGAL,homo,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第28页,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第29页,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第30页,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第31页,试验设计,请介绍除了NCBI以外SNP数据库及其使用；,查询人Fascin，Ezrin，NGAL receptor等基因SNP位点，列出它们编码区SNP，讨论这些SNP对蛋白结构与功效影响；,请列举检测SNP试验技术，并评价其优缺点；,请设计一个试验检测一个基因SNP，并分析这些SNP与某种疾病关系；,若要判断SNP与疾病有显著关系，需要什么条件。,WWW.Ggene.Cn,生物基因组序列比对分析专家讲座,第32页,