基因工程PCR课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 聚合酶链式反应,（,PCR,）,基因扩增（,gene amplification),1.,环境诱发扩增,在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。,2.,基因的程序性扩增,在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中,rRNA,基因的扩增。,3.,基因组进化扩增,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。,4.,基因工程扩增,载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,5.PCR,扩增,应用聚合酶链式反应（,Polymerase Chain Reaction,，,PCR,）技术，在体外特异性地扩增某个基因。,5.1,（,1,）,1971,年,Khorana,提出体外人工复制,DNA,的设想。,由于引物和,DNA,聚合酶及,DNA,测序技术都没有解决，设想未能实现。,（,2,）,1985,年,Cetus,公司的科学家,K.B.Mullis,发明了,PCR,，使这一设想变成现实,PCR,的发明,Mullis,由此获得,1993,年诺贝尔化学奖。,（,3,）,Taq DNA,聚合酶,1986,年,H.A.Erilish,从嗜热水生菌分离出耐高温的,Taq DNA,聚合酶，代替,Klenow,片段，,PCR,技术才进入实用阶段。,1988,年,R.K.Saiki,把,Taq DNA,聚合酶用到,PCR,反应中，使,PCR,自动循环仪成为可能。,（,4,）,PCR,仪,1988,年,Cetus,公司发明自动热循环仪。,5.2,PCR,扩增原理,PCR?,是在模板,DNA,、引物和,dNTP,S,存在的条件下依赖于,DNA,聚合酶的酶促合成反应。其扩增原理是以半保留复制的形式进行，在体外进行,DNA,的,变性、退火和引物延伸,三个阶段的循环反应。,Polymerase Chain Reaction(PCR),根据已知的,DNA,核苷酸序列从两个,5,-,端合成两条,16,24bp,的引物,要进行,PCR,反应，必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚，,至少要预先知道足够合成一对引物的靶,DNA,序列,。就可通过,PCR,反应，直接从染色体,DNA,或,cDNA,上高效快速地扩增出目的基因片段。,5.3,PCR,技术特点,pg,、,ng,的,DNA,模板分子即可。,（,1,）特异性强,错配率约万分之一（,2,10,4,）。扩增产物的特异性取决于,引物,和模板,DNA,结合,的特异性。,（,2,）敏感性高,（,4,）简便,扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先克隆再做序列分析。,（,3,）快速,整个,PCR,过程约,4hr,完成。样品处理约,1hr,，,PCR 2hr,，产物凝胶电泳分析约,1hr,。,Clark,发现用,Taq DNA,聚合酶得到的,PCR,反应产物不是平末端，而是有一个突出,A,碱基末端的双链,DNA,分子，根据这一发现设计了克隆,PCR,产物的,T-,载体,。,利用,Taq polymerase,的特性,利用,restriction enzyme,（,5,）可扩增,RNA or cDNA,有些外显子分散在一段很长的,DNA,中，难于将整段,DNA,大分子扩增和做序列分析。若以,mRNA,作为模板，可将外显子集中，用,PCR,一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析。,RT-PCR,：,先用逆转录酶将,mRNA,合成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行扩增。,模板可以是,cDNA,的第一条链，也可以是总,DNA,。,对大批量,PCR,产物分析不影响，但用于克隆的,DNA,，必须检测克隆产物的,DNA,序列。,（,6,）对材料（模板）质量要求低,微量、粗制及部分降解的,DNA,材料都可作为起始材料。,（,7,）有一定程度单核苷酸错误掺入,5.4,PCR,反应,体系,1.Taq DNA,聚合酶,热稳定性,Taq DNA,聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合,PCR,过程的反复高温变性要求。,最适温度高,最适温度：,75 80,延伸速度：,35150 nt/(s,酶分子,),最长延伸长度：,6.7kb,Taq,酶的缺点,具有,5,-3,聚合酶活性和,5,-3,外切酶活性，但没有,3,-5,外切酶活性，因此不能修正错误的碱基配对！,合成超过,600bp,长度的,DNA,就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,其它耐热的,DNA,聚合酶,Tth DNA,聚合酶,无,3,5,DNA,外切酶活性，但高温下能逆转录,cDNA,，又能扩增,DNA,。,VENT DNA,聚合酶,有,3,5,外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受,100,高温。,Pfu DNA Polymerase,有,3-5,的外切酶活性，,5-3,外切酶活性。,是目前已发现的所有耐高温,DNA,聚合酶中出错率最低的。但,PCR,产物为平端！,Taq Plus DNA Polymerase,是,Taq,和,Pfu DNA,聚合酶的混合物。,Taq,的,PCR,产物,3,端往往带有一个,A,。,纯度,PCR,对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、尿素、,SDS,、,EDTA,等试剂。,用量,一般,50l,反应体系中,50ng,即可，模板太多，会令扩增失败。,2.,模板,(template),3.,引物（,primer,）,终浓度,0.5mol/L,4.dNTPs,浓度,一般反应体系中,dNTP,混合浓度为,200mol/L,，,浓度过高会抑制,Taq DNA,聚合酶的活性并增加错配率。,5.Mg,2+,浓度,2.0mmol/L,Taq DNA,聚合酶对金属离子的性质和浓度较敏感，特别是,Mg,2+,。,在,4,种脱氧核苷酸,dNTP,的总浓度,0.2mmol/L,时，浓度为,2.0mmol/L,的,MgCl,2,能最大程度地激活,Taq DNA,聚合酶的活性，过高则对酶活性表现出一定的抑制作用。,5.5 PCR,反应条件,1.,变性：,94,95,，,1min,，预变性,510min,。,2.,引物的退火：,T,m,=,（,G+C,）,4+,（,A+T,）,2,。,实际复性温度低于,T,m,值,5,，当引物中（,G+C),含量低于,50%,时，复性温度低于,55,。,提高退火温度，可提高引物与模板结合的特异性,。时间,30,60s,。,3.,延伸温度和时间：,一般,72,，,1min,。,延伸时间过长，非特异扩增带出现，但最后一步可延长,4,10min,，使反应完全，产量高。,4.,循环数：,25,40,周期，次数少，产量不够；次数过多，反应停止，呈平台效应。,5.6 PCR,引物,设计原则,a.,长度,15,30bp,，,Tm 55,75,。,b.G+C,占,50%,60%,，避免单一碱基的连,续排列，一般两端,G+C,含量近似。,c.,引物,3,端必须与模板,DNA,互补。,d.,一对引物间连续互补碱基小于,4,个。,e.,引物本身应避免有回文序列。,4,10,=1.0510,6,(,百万,),4,20,=1.110,12,(,万亿,),引物的长度,一般引物设计为长,15-30bp,。,即,1.110,12,bp,的基因组中有一次完全,与,20,个核苷酸的序列相同的机会,6 12bp,为随机引物，在基因组中与随机引物完全相同的序列可能有多个，因而扩增时可以产生多个片段，因此多用于生物的分类学研究。,引物的碱基序列,3,端必须与模板正确配对，,5,端可以不配对。,5,端根据需要可设计成某个,内切酶的切点顺序、,RNA,聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记,等，方便与以后操作。,引物的碱基组成,提高,G+C,含量，以提高引物与模板的结合力。,避免连续相同碱基排列或内部回文序列。,避免形成引物二聚体（,dimer,）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,简并引物：,根据蛋白质的氨基酸序列设计,一组混合,引物来合成相应的基因。,例如：,His Phe Pro Phe Met Lys,5,-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3,其中：,Y=,嘧啶,(UC),，,R=,嘌呤,(AG),，,N=,任意碱基,该序列具有,2,2,4,2,2=64,倍简并性，其中之一必是正确的。,组 苯丙 脯 甲硫 赖,嵌套引物,（,nested primers),：,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。利用第一轮,PCR,扩增产物作为第二轮,PCR,扩增的起始材料，进行二次,PCR,扩增。这样能够使靶,DNA,序列得到有效的选择性扩增，增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件,如,Primer5.0,等,5.7 PCR,技术的扩展,技术关键：,把线性,DNA,模板转变成环形分子，,使引物的外侧序列,“,转变,”,成内侧序列。,（,1,）反向,PCR,扩增两个引物外侧的未知序列（传统,PCR,只扩增两个引物之间的已知序列）。,技术关键,：,两个引物的浓度相差,100,倍。,低浓度的引物（限制引物）首先,耗尽,，随后只有高浓度的引物，继续合成单链,DNA,，最后产物中,99%,是单链,DNA,。,可用于,Sanger,法测序。,（,2,）不对称,PCR,用于扩增单链,DNA,，单链,DNA,更适于测序。,技术关键：,利用反转录酶，把,RNA,反转录成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增。,（,3,）反转录,PCR,（,RT-PCR),扩增,RNA,模板。如,mRNA,或,RNA,病毒。,Temin,H.,发现反转录酶，,1975,诺贝尔奖,5.8 PCR,技术的应用,（,1,）扩增某一段,DNA,基因组克隆：,突变基因同野生型基因的比较。,通常先构建突变体的基因文库，再应用杂交筛选等一系列烦琐的步骤，分离到所需的克隆。然后对突变基因测序并同野生型进行分析比较。,利用,PCR,则可根据野生型基因的序列，设计一对合适的引物，从基因组,(,突变体,),中直接扩增突变基因,DNA,产物，供测序使用。,技术关键：,利用引物的,5,端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,（,2,）基因的体外诱变,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链,DNA,分子进行复制，随后这条引物便成为新合成,DNA,子链的一个组成部分,缬,苏,克服单链引物法只能诱变,5,的局限性,（,3,）基因组的比较研究,比较不同物种之间的基因组特征和相似性。利用,6bp,长度的随机序列引物扩增细胞中的总,DNA,，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。,类似于限制性内切酶片段长度多态性（,RFLP,）分析，因而也称为随机扩增多态性,DNA,（,Random amplified polymorphism DNA,RAPD,）分析。,随机引物非定点地扩增基因组,DNA,，然后用,凝胶电泳分开扩增片段。,基因组,DNA,如果在特定引物结合区域发生,DNA,片段插入、缺失或碱基突变，就有可能,导致引物结合位点的分布发生相应的变化，,导致,PCR,产物增加、缺少或发生分子量变化。,PCR,可以比较两种不同生物的基因组的差异。,亲缘关系较近的两种生物比较远的生物产生,更多的相同的条带。,（,4,）,DNA shuffling works,Similar mutants generated by,error-prone PCR,random and,site-directed mutagenesis,Generating chimeras with,crossovers of large blocks,of sequences,1,、,Template PCR,2,、,DNAseI digest,3,、,PCR without,primers,4,、,PCR with,primers,