生物样品内中药制剂化学成分的测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章,生物样品内中药制剂化学成分的测定,1,概述,生物药物分析的对象,药物所到之生物体的,体液、器官、组织、排泄物,等,。,生物药物分析的目标,母体药物和代谢产物,生物药物分析的意义,药物质量的正确评价,临床合理用,药,1,概述,生物药物分析的特点,生物样品中被测组分的存在形式多样,原型药（游离型）、结合型、代谢物、缀合物等,被测组分浓度低,(,10,-6,-10,-9,g/ml),，变化幅度大,样品干扰物质多，部分样品稳定差,样品量少,要求较快提供结果,测定数据的处理和阐明有时不太容易,1,概述,生物药物分析的任务,分析方法学的研究,药物浓度的监测,药代动力学的研究,生物样品内内源性物质的测定,2,药物在生物体内的存在状态与生物转化,药物在生物体内的存在状态,药物代谢,保证临床用药的安全、合理和有效,药物代谢的部位：,肝脏、肾、脾、肺、肠粘膜、胎盘等,药物代谢反应,第一阶段（一相）：细胞色素,P450,等催化下的氧化、还原、水解等反应，增大极性,第二阶段（二相）：与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结合，进一步增大极性，随尿排出,3,生物样品的制备,常用生物样品,生物样品的选取原则,能够反映出浓度与药效之间的关系,易于获得,便于处理,根据不同目的和要求进行选取,3,生物样品的制备,常用生物样品,常用生物样品的种类、特点与采集,血浆,(plasma),血样,血清,(serum),全血,(whole blood),尿液,(urine),用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究,尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿中药 物总量。,尿液与血液中药物的相关性差。,尿中药物大多呈缀合状态。,3,生物样品的制备,常用生物样品,常用生物样品的种类、特点与采集,唾液,(saliva),用于药物浓度监测和药代动力学研究,其他,动物脏器组织匀浆等,样本的代表性,力求取样条件标准化,样品的贮存,血样,离心，冷冻保存,尿液立即测定，否则应冷藏或加防腐剂,3,生物样品的制备,样品预处理,提取方法的选择依据,药物的理化性质,-,酸碱度、极性、挥发性、可能的生物转化途径等,药物的浓度范围,药物测定的目的,生物样品的类型,样品处理与分析技术的关系,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的提取,蛋白质处理,利用蛋白质脱水沉淀,有机溶剂、中性盐等,利用蛋白质形成不溶性盐沉淀,酸性沉淀剂,（,TCA,、高氯酸、苦味酸等）,重金属盐,（,Zn,2+,、,Cu,2+,）,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的提取,蛋白质处理,其他方法,加热,离心、超滤和透析,分析游离的待测组分,酶消化法,分析与蛋白质强结合的待测组分,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的提取,缀合物（结合物）水解,酸水解,无机酸,简便快速，但专属性差，有可能造成被测物分解。,酶水解,葡萄糖醛酸苷酶,(,glucuronidase,),芳基硫酸酯酶,(,arylsulfatase,),专属性强，一般不会造成被测物分解，但水解时间长，费用高。,溶剂解,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的提取,冷冻干燥,适用于,-,大批量的生物样品,-,水溶性很强的样品,-,挥发性样品,-,对热不稳定的样品,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的分离与净化,液,-,液萃取,萃取率：不低于,50%,影响提取率的因素,pH,值,提取溶剂,离子强度,离子对提取,3,生物样品的制备,样品预处理,药物的分离与净化,液,-,固萃取,固相提取柱（使用硅藻土、氧化铝、离子交换树脂、活性炭等填充剂）,“干混合物”萃取,待测组分的富集,真空挥发或通气流挥发,衍生化处理,3,生物样品的制备,样品预处理,待测物的损失,吸附、化学降解、衍生化反应、络合、蒸发,样品玷污,增塑剂,脂肪酸和酯类,其他,4,生物样品,内药物分析方法,分析方法建立的一般步骤,以纯品进行测定,确定线性范围、最适测定浓度、灵敏度、最佳测定条件等,空白样品测定,以水代替空白样品，添加对照品后测定,了解提取回收率和最低检测浓度的大致情况,空白样品中添加对照品后测定（回收率实验）,实际样品测定,4,生物样品内药物分析方法,方法的评价,准确度（,accuracy,）,回收率,相对稳定,与参比方法相比较,相关系数,r 0.95,精密度（,precision,）,各浓度点,RSD,不应大于,15%,，最低定量限不应大于,20%,。,灵敏度,检测限,(LOD),、定量限,(LOQ),、最低检测浓度,4,生物样品内药物分析方法,方法的评价,方法的专属性（,specificity,）,注重考虑代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰,线性范围,-,相关系数,r 0.99,样品稳定性考察,长期贮存,(-20/-70),、短期室温贮存,冷冻,-,解冻循环稳定性,贮备液稳定性,5,生物药物分析的,常用测定方法,光谱法,紫外可见分光光度法,荧光分光光度法,色谱法,电泳法,免疫分析法,6,应用实例,人尿中槲皮素含量测定,取,15mL,氩气消泡后的尿液，用,0.12mol/L,醋酸盐,(,含,1%,抗坏血酸,),调尿液,pH,至,5,，样品中加入,1,g,漆树黄酮做内标，用葡萄糖醛酸苷酶,/,芳基磺胺酶在,37,温孵,1h,震荡水解，取,500mg,反相,C18,填料，甲醇湿润装柱，随后用,1%,甲酸,5mL,平衡,ODS,柱，酶解后的尿液上样，流速为,5mL/min,左右，用,3mL5%,甲醇和,3mL90%,甲醇,(,含,1%,甲酸和,1%,抗坏血酸,),洗脱，最后用,3mL,甲醇洗脱。馏分合并，真空吹干，残渣用,150uL,甲醇复溶后进样。,NielsenSE,et al,.,J,Chromatogr,(B),1998,707(2):812891,五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究,色谱条件,：,KromasilC-18,色谱柱,(4.6mm150mm,粒度,:5um);,流动相为甲醇,-,水,(80:20);,流速,1.0mlmin;,检测波长,254nm;,柱温为室温。,给药方法：,昆明小鼠,456,只，雄性，置相对湿度,45%,75%,、温度,(251),动物试验室饲养,3d,，禁食过夜，自由饮水，次日按体重分层，随机分组，每时间点为一组，每组,4,只，五灵胶囊按,16.6g/kg(,相当于人体给药剂量,10,倍,其中含五味子乙素,45.0mg),给药,分别在,0.16,0.32,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,7.0,8.0,10.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0,26.0,28.0,32.0h,眼眶采血，置于肝素钠的离心管内，室温放置,30min,，,3000rmin,离心,10min,分离血浆,每组血浆合并置,-20,冻存。乙素供试品按,45.0mg/kg,给药,分别在,0.16,0.32,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,8.0,10.0h,采血，同上法操作得血浆，,-20,冻存。,五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究,血浆供试品溶液、血浆乙素供试品溶液与阴性供试品溶液的制备,取上述依时间点取每组小鼠混匀血浆,0.7ml,，分别加,0.25g,硫酸胺，振荡混匀,1min,，再加乙腈,-,甲醇,(4:1),溶液,4ml,，振荡混匀,3min,，,3000rmin,离心,20min,，取上清液置蒸发皿内，于,40,水浴上用氮气吹干，残渣加色谱甲醇溶解至,1ml,，摇匀，,-20,放置过夜。次日用,0.22Lm,微孔滤膜抽滤，作为血浆供试品溶液。取上述乙素供试品依时间点取每组混匀血浆,0.7ml,，按供试品溶液的制备方法制得血浆乙素供试品溶液,另取五灵胶囊缺五味子阴性样品和供试品溶液的制备方法制得的阴性供试品溶液。,结论：五味子乙素在小鼠体内从吸收到消除历程,10h,，五灵胶囊中乙素在小鼠体内从吸收到消除历程大于,32h,。方剂改变了处方中主要成分在体内动力学参数，使有效成分在血中滞留时间延长，生物利用度提高，从而增强了药物的治疗作用。,王胜春等,.,时珍国医国药,.2004,15(8),