液相色谱应用教程课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,怎样用好高效液相色谱,福立分析仪器有限公司,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,常见的液相色谱仪问题,色谱峰加宽,分辨率低,裂峰,柱压比预期值高,液 相 色 谱 仪 的 使 用,正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下：,相对比较便宜,不需要花费大量的时间,系统中大多数流体连接均易于检修,通常有助于避免不必要的硬件替换,接头对正确连接至关重要，因此知道接头的,一些基本特点也很重要。,液相色谱仪的正确连接,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头的普通特征,螺纹,（,10-32,，,-28,，,M6x1,）,管道外径,（,1/16”,、,1/32”,、,1/8”,）,端口几何形状（锥形、平底）,管套直径,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,套圈固定管道，并且始终以相同方式固定,用力按入圆锥形端口，如下图所示,套圈锥度,（或角度）,端口锥度,（或角度）,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,然后在套圈接触内套处压紧管壁。,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,通用端口有以下特征：,螺纹,管道尺寸,内部几何形状,但并非所有的接头都是通用的,!,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,管套的深度并非通用,!,即使是最好的接头，如果不正确使用也会,产生许多问题。为什么会出现问题？,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因：,如果前端太长，套圈不能密封因而会发生泄漏,如果前端太短，套圈可以密封但是将会导致,无效空间和混合的发生,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,连接出现泄漏后将会引发以下问题：,系统压力损失,注射假象（鬼峰）,出现混合室（死体积）将会引发以下问题：,色谱峰加宽,分辨率减低,显著残留,裂峰,引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生,!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,选择匹配的接头时，应首先清楚以下问题：,使用的端口螺纹类型（例如，,10-32,、,-28,等。）,使用的端口几何尺寸（例如，锥形或平底）,所需连接的管道外径（例如，,1/16”,，,1/8”,）,是否可以手动紧固连接,接头应与哪些化学药品兼容,接头应该承受多大压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑：,管道的正确型号,管道的最有效尺寸,切割管道的合适工具,如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,如果您想选择适合应用需要的管道类型，请考虑以下问题：,管道在系统中的使用位置,哪种管道材料能够实现最好的兼容性,产生多少压力,可提供多种不同类型的管道,高压管道：不锈钢、,PEEK,、,Radel,R,、,PEEKsil,等。,低压管道,:Teflon,FEP,、,Teflon,PFA,、,Tefzel,等。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题：,接受端口需要什么尺寸的管道？,流速多少？,管道将会产生多大压力？,接头提供的管道尺寸是多少？,请始终注意,-,高压管道最常见的尺寸为：,1/16”OD x.010”ID,-,低压管道最常见的尺寸为：,1/8”OD x 1/16”ID,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,这是系统低压、,高流量区域。,这是系统高压、,低流量区域。,这是系统低压、,低流量区域。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,在具体应用中，仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够，但是,如果管道切割不当，那么结果可能仍不理想。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,正确的切割技术确实能影响色谱法的质量,不正确切割 正确切割,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,储液器和泵之间的管道连接,管道通常用,Teflon,材料制造，尺寸为,1/8”OD x 1/16”ID,。,将管道连接至泵上的接头通常为,-28,螺纹，平底几何形状。,泵和检测器之间的管道连接,管道通常用,PEEK,聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为：,1/16”OD x.010”ID,或稍小。,将管道连接至系统部件上的接头通常为,10-32,螺纹，锥形,几何形状。,检测器之后的管道连接,管道通常用,Teflon,材料制造，尺寸为,1/16”OD,选择正确接头和管道的一般准则,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,管道内径的公英制换算,内径,体积,内径,体积,英寸,mm,uL/cm,英寸,mm,uL/cm,0.005,0.13,0.13,0.03,0.75,4.56,0.007,0.18,0.25,0.04,1.00,8.11,0.01,0.25,0.51,0.046,1.20,10.72,0.02,0.5,2.03,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,HPLC系统不同部位的管道,部位,种类,内径/mm,长,说明,储液器泵,聚四氟乙烯,1.6,随意,能透氧,泵进样器,不锈钢管,1.0,随意,进样器定量管,不锈钢或PEEK,视定量管体积而定,进样器柱,不锈钢管,0.20.25,尽量短,柱检测器,不锈钢或PEEK,0.20.25,尽量短,检测器放空,聚四氟乙烯或聚乙烯,0.25,随意,需要时加长到1米，增加流过池出口压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,不同色谱柱的管道使用指南,色谱柱/(1mL/min),不同内径(mm)管柱外峰宽效应5时最大长度/cm,柱长(mm),内径(mm),填料粒度um,塔板数,0.18mm,0.25mm,0.5mm,33,4.6,3,4400,22,9,8,50,4.6,3,6677,33,14,8,100,4.6,3,13333,67,27,8,150,4.6,5,12000,167,68,8,250,4.6,5,20000,278,114,8,250,2.0,5,20000,50,20,8,250,1.0,5,20000,12,8,8,液 相 色 谱 分 析,分析型液相色谱,定性及定量分析,a.灵敏度的要求,b.样品的复杂性,c.样品量的要求,d.精度及准确度的要求,e.容易使用,液 相 色 谱 分 析,制备型液相色谱,分离及纯化,a.化合物的稳定性,b.样品的复杂性,c.制备量的要求,d.纯度的要求及纯度的鉴定,e.方法的安全性,液 相 色 谱 分 析,Q：,需要什么样的分离结果？,A：,分辨率高,。,液 相 色 谱 分 析,什么是色谱的分辨率？,分辨率R的公式：,液 相 色 谱 分 析,影响分辨率的因素：,K，,a，N,分辨率的方程：,K,是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。,a,是,选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度，,是化学因素。,N,是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式：,液 相 色 谱 分 析,提高柱效的方法,色谱柱本身,减小填料的颗粒度,找到最佳的流速（根据不同的内径）,合适的温度,降低溶剂的粘度,增加柱长,液 相 色 谱 分 析,其他影响柱效的因素,柱外效应,连接管路,进样器,检测器,进样体积,样品浓度,液 相 色 谱 分 析,容量因子,K,与峰高的关系 与R的关系,改变,K,值的方法：,调节流动相的极性、,pH,、,离子强度等,梯度淋洗,k,=(t,R,-t,0,)/t,0,液 相 色 谱 分 析,选择性系数a,定义：,a1时两组分分不开，,改变a的途径：,改变流动相,改变固定相,改变温度,改变样品的本身性质,液 相 色 谱 分 析,a、K、N,如何控制分辨率,原始分离状态,改变,K,后,改变,a,后,改变 N 后,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,等度分析,色谱柱：C18，4mm30mm,流动相：乙腈,/,水，不同的溶剂强度，,60/40,、,50/50,、,40/60,，由强渐弱,流速：,2ml/min,样品：,对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl,Paraben,),对羟基苯甲酸丙酯,(,Propyl,Paraben,),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl,Paraben,),液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变容量因子,K,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变选择性,a,通过改变流动相改变选择性,同样强度的不同溶剂,改变色谱柱,1,2,3,THF/H,2,O,28:72,MeOH/H,2,O,58:42,CH,3,CN/H,2,O,38:62,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法的建立,梯度洗脱的特点,优点,单位时间的分离能力增加,检测灵敏度提高,缺点,仪器设备要求高,不适合某些检测方式,柱需再生,定量分析的重复性较低,分析时间长,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,溶剂 A,溶剂 B,泵 A,泵 B,混合器,A 高压梯度,溶剂 A,泵,溶剂 B,比例阀（溶剂混合点）,混合器,B 低压梯度,（溶剂混合点）,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度洗脱的可变参数,A,及,B(,可能还有,C,和,D,液,),的,成分和化学特性,梯度的陡度,梯度的变化形状,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,如不用梯度：分离不理想,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度条件的优化,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凹线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凸线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。,