细菌质粒(与“质粒”有关的文档共25张)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细菌质粒,第一页，共25页。,质粒的定义,是一种细胞质遗传因子，是细菌细胞内独立于染色体外的一种复制子，它在细胞分裂时能衡定的传给子代细胞，并能给细胞带来表型效应，但它的消失并不影响细胞的生存。,质粒,第二页，共25页。,第一节 质粒的检测,一消除法（,curing,）,间接推测,二直接观察法,（,三）电镜直接观察,（一）氯化铯,溴化乙锭（,CsCL,EB,）密度梯度离 心（图,3-1,）,（二）琼脂糖凝胶电脉,三重新感染试验法,柯赫法则,第三页，共25页。,1,2,3,4,1,2,3,4,1,2,3,4,a,b,c,1.,蛋白质,3,.,质粒,DNA,2.,染色体,DNA,图,3-1 CsCI,密度梯度示意图,第四页，共25页。,第二节 细菌质粒的种类,细菌质粒种类繁多,目前主要根据其表型效应命名并划分为不同的类型,目前在大肠杆菌中发现的质粒类型主要有三种,:,即,性质粒,、,抗性质粒,和,产大肠杆菌素质粒,。,1,性质粒,：具有促进细胞结合的表型效应。,2,Col,质粒,（又称大肠杆菌质粒）：可以产大肠杆菌素的大肠杆菌质粒。,一细菌质粒种类的划分,第五页，共25页。,3,抗性质粒,：能对不同物质，其中包括抗生素、化学药物、重金属等物质表现出抗性的一大类质粒的统称。,4,降解质粒,：这一类质粒能利用许多不容易为一般细菌分解的物质作为碳源供细菌生长。目前只在假单胞杆菌中发现。,第六页，共25页。,5,Ti,质粒,（,Tumor inducing,），,Ti,质粒是一种寄生在根瘤农杆菌（,Agradacterium tumefacxiens,）中，并能感染植物（主要是双子叶）的茎形成寇瘿瘤的一种质粒。,7,共生固氮质粒,：存在于不同根瘤菌中，并能相应的豆科植物进行共生固氮的一类质粒。,6,隐蔽质粒,：目前还没有发现它表现出任何性状的质粒。,第七页，共25页。,A,直接法：根据质粒分子量和质粒,DNA,的总量来测定,B,间接法：,1,）使质粒处于不复制状态下，测定开始出现不含质粒的细菌所经历的分裂次数；,2,数量,：测定质粒的数量是以拷贝数来表示，拷贝数的测定一般有两种方法：,1,大小,：一般分子量在,1-1010,6,d,的质粒，大于此分子量的为大质粒。,二质粒的大小和数量,拷贝数,=,质粒的,DNA,总量,质粒分子量,第八页，共25页。,三、质粒复制的类型,严谨型（,strigent,）质粒,：它的复制除变自身的基因控制外，还要严格的受染色体的控制。,松驰型（,relaxed,）质粒,：它的复制主要受自身基因的控制，受染色体控制影响极少。,四质粒转移类型,（一）质粒的转移与供受体细菌的关系,（二）带动转移,2,）利用质粒的某些表型效应来测定。,第九页，共25页。,五质粒的不亲和群（,incompatible group,）,质粒产生不相溶性存在的两种假说：,1,两个质粒结构相同，复制能力相同，一个先进入细胞复制后产生阻遏物抑制了后一质粒的复制。,2,膜位点假说：两个质粒的复制位点相同，互相竞争同一位点而产生不相溶性,第十页，共25页。,0,10,20,2,5,10,20,50,100,0,10,20,0,10,20,Km,AP,AP,Sm,Km,Sm,A,B,C,繁殖代数,双重抗性细菌（,%,）,大肠杆菌质粒的不亲和性和亲和性现象,和,pSC101-AP,的不亲和现象；和,ColE1-SmSu,的不亲和现象；,C.pSC101-Km,和,ColE1-SmSu,的亲和现象。,Km:,卡那霉素；,Ap:,氨苄西林；,Sm:,链霉素；,Su:,磺胺。,第十一页，共25页。,第三节 细菌质粒的复制,以大肠杆菌的,F,质粒为例，证明严谨型质粒的复制既受寄主染色体的控制又受质粒自身的控制（图,3-2,）,二复合复制子的复制,1,质粒与染色体合并后的复合复制子,1,）整合后，质粒随（受）染色体控制,2,）整合后，染色体的复制受质粒控制,一,严谨型质粒的复制特点,第十二页，共25页。,F,-,lac,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,涂布,Lac,-,30,0,C,培养,影印,影印,30,0,C,培养,EMB,培养,42,0,C,培养,EMB,培养,30,0,C,红,白,第十三页，共25页。,Fts,-,lac,+,(,质粒的复制呈敏感突变）,将,Fts,-,lac,引入一个非温度敏感的宿主,丫啶消除,Fts-lac,质粒,Lac,-,Fts,-,lac,+,42,白,（质粒本身性质）,42,红（染色体结构控制了,F,的复制）,引进一个野生型的,F-lac+,Lac,-,F,-,lac,+,42,白,（染色体控制）,42,红（质粒本身的性质决定）,图,3-2,第十四页，共25页。,2,质粒与质粒合并后形成嵌合质粒的复制,1,）当两种嵌合质粒的复制都不受抑制情况下，复合复制子受拷贝数多的质粒控制,PSC101,和,COLE1,是大肠杆菌的两种质粒，它们的特征见表,3-3,。,表,3-3,质粒,分子量,（道尔顿）,每一细胞,中质粒数,转移性,标记,复制条件,PSC101,5.810,6,6,非,TC,R,细菌的蛋白质合成,COLE1,4.210,6,18,非,细菌的,DNA,多聚酶,第十五页，共25页。,2),当它们整合后形成的嵌合质粒为,PSC134,，它们的复制特征见表,3-4,。,表,3-4,宿主细菌和所带的质粒,复制开始的部位,COLE1 PSC101,相当于每一染色体的质粒数,宿主细胞的四环素抗性,(,单位,/,毫升,),CR34POLA1,+,(PSC134),36 0,16,80,W3110POLA1,-,(PSC134),0 14,6,25,CR34POLA1,+,(PSC101),-,5,25,C600POLA1,+,(COLE1,PSC101),-,18,5,30,第十六页，共25页。,三,.,复合质粒的复制机制,对于复合质粒的复制机制,目前存在着两种假说模型,:,一种是正控制假说模型；另一种是负控制假说模型。,对于,正控制假说模型,又有两种解释：,1,膜位点的正控制模型：该模型认为质粒必须附着在细胞膜的某一特写部位才能开始进行复制，而且每一专一的膜位点控制着复制的拷贝数。,2,物质扩散的正控制模型：这种模型假定为细胞内能产生一种可以扩散的物质，此物质促使,DNA,开始复制。,第十七页，共25页。,负控制假设模型,认为,：,质粒复制的过程中，细胞产生一种专一的阻遏蛋白，它能抑制质粒进一步复制，只有当阻遏物稀释到一定的浓度（即消除了阻遏），质粒的复制才又开始，所以每一质粒总保持一定的拷贝数。,第十八页，共25页。,第四节 质粒在遗传工程中的应用,一遗传工程的概念,狭义的遗传工程即通常称为基因工程。,（一）,遗传工程,定义,是采用类似工程设计的方式，按照人们预先设计的蓝图，把我们所需要的某一供体生物的遗传物质,DNA,大分子提取出来，在离体条件下进行剪切，获得我们所需要的目的基因，然后把它和载体,DNA,连接起来，巧妙地输入到某一受体细胞中去，使外源,DNA,在其中复制、扩增、转录、翻译，以至最后能表达，这就是基因工程的全部过程。,第十九页，共25页。,（二）遗传工程与一般细胞发生的重组的区别,细胞内基因重组的特点,：,1,外源,DNA,需要整合致染色体上；,2,由于重组，所以受同源的限制，有同源性才能发生重组；,3,同源重组是在细胞内进行的；,4,基因产物少。,遗传工程的特点,：,1,遗传工程不需要在细胞内进行，而是在体外人工地进行重组，所以基因工程是分子水平的操作，细胞水平的表达；,第二十页，共25页。,（三）基因工程的过程,4,从受体细胞群体中筛选出含有重组,DNA,分子的细胞，建立无性繁殖系。,1,获得目的的基因（直接从生物体中分离或人工合成）；,2,把目的基因和载体结合成重组,DNA,分子（体外重组）；,3,把重组,DNA,分子引入到相应的受体中去（转化或传染）；,2,外源,DNA,不是整合到染色体上，而是结合在另一个小的复制子上（载体），由于载体能独立复制，所以重组不受同源的干扰，产物也能成倍增加（拷贝数多）。,第二十一页，共25页。,二、质粒在遗传工程中的运用,6,安全性能要好（一般要求是非转移型的）,（一）质粒作为遗传工程的载体必须符合以下条件：,1,要求在宿主的细胞内能独立复制，最好是松驰型的,2,要求有一定的选择性标记,3,要有单一的限制性核酸内切酶的酶切位点,4,分子量要尽可能的小,5,要利于外源基因的表达,第二十二页，共25页。,（二）载体的改造,1,利用限制酶把作为载体的质粒上某些不必要的片段（即不影响复制的前提下）尽量去掉,质粒,PBR322,的改造过程如图,3-4,4,质粒安全性能的改造,2,便于检出重组质粒，要求作载体的质粒必须带上某种标记，一般以抗药性标记为最好。,3,利于外源基因表达的改造,第二十三页，共25页。,第二十四页，共25页。,三、遗传工程中的工具酶,1,限制性核酸内切酶和修饰酶,2,连接酶,3,末端转移酶,4,单链核酸酶,5,反向转录酶,第二十五页，共25页。,