化学发光法检测传染病

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,化学发光法快速检测传染病,更灵敏、更特异、更准确,放免,酶联免疫,化学发光,荧光免疫,60,年代,70,年代,80,年代,90,年代,免疫标记技术发展,国产,进口,酶促化学发光,直接化学发光,化学发光技术的优势与应用前景,.,敏感,度高，(10,-21,mol/L),超过酶免，荧光免疫等方法,.,精密,度，,准确,度超过放免，酶免，荧光免疫等方法,.,试剂,稳定,，无放射性，污染或生物毒性；,.,测定耗时短，方便,快速,提供结果报告；,.,测定,项目齐全,；,已发展成,全自动,的测定系统。,包被微粒子,包被磁珠,包被微孔,包被试管,包被技术的发展,-,磁微粒子,包被磁微粒 标记异鲁米诺,Eg:,双抗夹心法分析模式,磁微粒子上包被的抗体与待检测抗原及异鲁米诺标记抗体结合,提升检测功能灵敏度,增加检测线性范围,比吖啶酯更稳定,延长试剂效期,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,*,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,微粒包被,液相反应,磁微粒、直接化学发光反应,反应充分,速度更快,酶标板，板式,磁微粒，纳米级，均相,CLIA,板式载量,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,磁微粒子,直接化学法,Ag/Ab,酶标板,发光板,Ag/Ab,微粒子化学发光法抗体载量优势,分配样品,磁颗粒,和试剂,孵育,使反应物,结合,在磁场中,清洗去除,未结合物质,加入,激发液,产生,信号,信号,检测,微粒子化学发光原理,磁性微粒子及其分离技术,磁性微粒子技术的优点：,快速分离结合相与游离相,提高与,Ag,或,Ab,包被亲和力,提高接触表面积/反应容量比例，实现微量分析,不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应,允许共价耦合反应，因此可以检测大/小分子的各种物质成分,能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围,如：夹心法，竟争法，抗体检测法等,利于检测自动化与微量分析,磁微粒子直接化学发光是,最新一代免疫检测新技术,具有,液相、快速、灵敏、准确,的特点,通过多中心的临床评估，基本上验证了,LICA,在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、肿瘤标志物、甲状腺功能等项目的临床可用性,多家临床试验显示产品的质量不亚于进口的雅培、罗氏和西门子等厂家的产品媲美。,1）,磁性微粒子技术：,便于分离，反应均匀，提高灵敏度,2）,泉涌内外壁清洗技术：,最小的交叉污染率,3）,试剂盒盖设计：,减少人工操作误差和交叉污染，避免试剂挥发影响结果准确性,4）,试剂冷藏系统：,保证在仪器操作的过程中试剂能够一直保持稳定,5）,磁性分离技术：,保证了清洗效率，对于灵敏度要求极高的标记免疫分析是十分关键的,技术,雅培,免疫项目,甲状腺功能,甲状腺素,三碘甲状腺原氨酸,游离甲状腺素,游离三碘甲状腺原氨酸,促甲状腺素,性腺激素,人绒毛膜促性腺激素,催乳素,雌二醇,卵泡刺激素,黄体生成素,孕酮,睾酮,肿瘤标志物,甲胎蛋白,癌胚抗原,前列腺特异性抗原,游离前列腺特异性抗原,糖类抗原125,糖类抗原15-3,糖类抗原19-9,2微球蛋白,铁蛋白,神经元特异性烯醇化酶,人钙结合蛋白,肿瘤相关抗原72-4,鳞状上皮癌相关抗原,细胞角蛋白CYFRA 21-1,心血管及心肌标志物,N末端脑钠肽,肌钙蛋白,肌酸激酶同工酶,C反应蛋白,心肌脂肪酸结合蛋白,脂蛋白相关磷脂酶A2,髓过氧化物酶,肌红蛋白,肝纤维化四项,透明质酸,型前胶原N端肽,型胶原蛋白,层粘连带白,传染病,乙型肝炎病毒前S1抗原,乙型肝炎病毒e抗体,乙型肝炎病毒e抗原,乙型肝炎病毒核心抗体,乙型肝炎病毒表面抗体,乙型肝炎病毒表面抗原,丙型肝炎抗体（HCV）,梅毒抗体（TP）,人类免疫缺陷病毒抗体,糖代谢类,胰岛素,C,-肽,全自动、管式、直接化学发光法,-,特异性强、性能稳定,超长时间无人值守,（,1,）试剂区,15,个试剂位，,（,2,）样本区,12,12=144,个样本位,（,3,）码垛区一次性装载,720,个反应杯,测试中可随时添加，随时替换,真正的,急诊功能,，急诊样本，随到随测。,测试速度高达,220,测试,/,小时,原试管上样,，无需倒管。,全封闭反应舱,，有效减少外界环境干扰和污染,全中文软件，图标式界面，,操作更简便,综合,测试成本低,管式、微粒子包被技术，反应速度更快，结果更准确。,ELISA,法检测乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照,2010,年,药典,规定反应时间至少要,2,小时,30,分钟；而全自动微粒子化学发光试剂则不到,30,分钟即可完成。,稳定性更好,特异性更好,大部分国际一流厂家也都采用直接发光法：,罗 氏,西门子,雅 培,.,传染病试剂传统酶免法和微粒子化学发光法对比,方法学,项目,传统酶免法,微粒子发光法,分析敏感度,特异性,精密度,分析敏感度,特异性,精密度,HBsAg,adr 0.1IU/mL,adw 0.1IU/mL,ay,0.2IU/mL,(-/-)20/20,(+/+)3/3,13.21%,adr 0.1IU/mL,adw 0.1IU/mL,ay,0.2IU/mL,(-/-)20/20,(+/+)3/3,8.03%,HBsAb,10 mIU/mL,(-/-)20/20,12.05%,10 mIU/mL,(-/-)20/20,7.45%,HBeAg,1,#,1:64,2,#,1:128,3,#,1:32,(-/-)15/15,(+/+)9/10,12.04%,1,#,1:64,2,#,1:128,3,#,1:32,(-/-)15/15,(+/+)10/10,8.03%,HBeAb,1,#,1:32,2,#,1:64,3,#,1:64,(-/-)15/15,(+/+)9/10,12.31%,1,#,1:32,2,#,1:64,3,#,1:64,(-/-)15/15,(+/+)10/10,8.20%,HBcAb,1,#,1:128,2,#,1:128,3,#,1:256,(-/-)15/15,(+/+)14/15,14.03%,1,#,1:128,2,#,1:128,3,#,1:256,(-/-)15/15,(+/+)15/15,10.34%,HCV,L1,、,L2,阳性，,L3,阴性，,L4,阴性,(-/-)29/30,(+/+)29/30,10.05%,L1,、,L2,阳性,L3,阳性，,L4,阴性,(-/-)30/30,(+/+)30/30,7%,HIV,S1,S2,阴性,S3,S4,S5,S6,阳性,(-/-)18/20,(+/+)20/20,14.34%,S1,阴性,S2,S3,S4,S5,S6,阳性,(-/-)20/20,(+/+)20/20,10%,TP,L1,、,L2,阳性，,L3,阴性，,L4,阴性,(-/-)20/20,(+/+)10/10,11.26%,L1,、,L2,阳性,L3,阳性，,L4,阴性,(-/-)20/20,(+/+)10/10,7.98%,参比试剂：雅培,I2000,乙肝,灵敏度,特异性,符合率,HBsAg,97.92%,100%,99.78%,Anti-HBs,95.98%,97.38%,96.69%,hiv,95.24%,100%,99.59%,Anti-HBe,90.77%,97.21%,95.36%,Anti-HBc,91.54%,98.9%,94.48%,试剂性能多中心临床评估（乙肝）,免疫测定试剂的关键点,作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键,如何选择好一个抗体,(,单克隆或多克隆,),去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它代谢产物有交叉反应,或着是一些没有临床意义的分解产物等，这是分析设计的重点中之重点。,批内、批间的分析重现性,。,AFP,HBsAg,4.50%,1.79%,4.91%,2.14%,HCV,1,2,3,4,5,Mean,SD,CV,批内,86.11,86.36,88.40,87.90,86.43,86.27,1.55,1.79%,批间,74.59,73.63,69.64,71.90,71.96,71.01,3.20,4.50%,HBsAg,1,2,3,4,5,Mean,SD,CV,批内,72.59,71.25,76.50,75.05,78.03,76.61,1.64,2.14%,批间,0.22,0.22,0.23,0.22,0.23,0.23,0.01,4.91%,批内,批间,微粒子化学发光试剂的精密度,相关性,相关系数,线性系数,HIV,显著相关,0.99,0.98,HCV,显著相关,0.93,0.99,参比试剂：雅培,试剂性能多中心临床评估,相关性,相关系数,线性系数,HIV,显著相关,0.97,0.92,HBsAg,显著相关,0.96,0.95,N=500,，,参比试剂：雅培,I2000,试剂性能多中心临床评估,丙型肝炎抗体诊断试剂,丙肝病毒复杂的基因结构：,决定了抗体谱的差异，从而为丙肝抗体检测敏感度的提高带来了困难。,丙肝诊断试剂目前存在的问题,1,、灰区标本的困惑,2,、阳性标本的漏检,问题形成的技术原因,-,灰区的形成,1,、重组抗原的原因,（,1,）融合蛋白,（,2,）大肠杆菌杂蛋白,2,、第二抗体的非特异反应,（,1,）酶标抗体对固相载体的直接吸附,酶标二抗对于丙肝抗体是非特异的，和各种人,IgG,均能反应结合。,（,2,）个别标本中,IgG,浓度过高,多聚体的混合：,E-E,、,E-Ab,、,E-Ab-E,、,E-Ab-E-Ab,，既引起本底背景，又阻遏抗原抗体反应,问题形成的技术原因,-,阳性标本的漏检,1,、关于灵敏度的两个概念,（,1,）分析灵敏度,决定因素：,a.,单个抗原决定族的抗原性强弱。,b.,试剂盒的信号放大能力,（,2,）流行病学敏感度,决定因素：,a.,抗原片段的种类是否齐全。,b.,是否含构像抗原。,c.,分析灵敏度的高低。,C,E1,E2/NS1,NS2,NS3,NS4a,NS4b,NS5a,NS5b,丙型肝炎病毒的基因结构,ELISA-1,st,RIBA-1,st,ELISA-2,st,RIBA-2,st,ELISA-3,st,RIBA-3,st,C22-3,C22-3,NS5,NS5,C100,C100,5-1-1,C33C,C100,C33C,C100,5-1-1,C33C,C33C,C100,C100,5-1-1,2,、抗原片段种类不全,3,、包涵体抗原，抗原性弱,4,、缺乏构像表位,5,、原核表达分子量小，抗原表位有限,6,、抗原非糖基化，稳定性差,7,、信号放大能力有限,8,、固相载体形成的空间位阻,问题形成的技术原因,-,阳性标本的漏检,新型丙肝化学发光试剂的关键技术,1,、包被和标记实现双特异，以降低假阳性率，并提高分析敏感度。,2,、通过整体系统优化，进一步扩大阴阳反差，使结果判读泾渭分明。,新型丙肝化学发光试剂技术策略,-,灰区的解决,1,、酵母真核表达抗原，高效减少灰区标本,eg:E.coli,与,Pichia pastoris,检测国标,国标品,表达载体,N2,N4,N24,P1,P5,P21,大肠杆菌,（原核表达）,0.260,0.149,0.235,0.742,2.659,0.706,毕赫酵母,（真核表达）,0.060,0.014,0.017,1.736,2.833,1.619,Anti HCV,重组,NS3,抗原,NS3 HCV,病毒的最重要的抗原,通过,酵母真核系统,成功的表达,NS3,抗原,多重折叠以达到,高度的免疫活性,高纯度,;,易于直接标记,2,、针对,Fab,端的单特异性抗体标记物,一般二抗,和,单特异抗体,的对比,国标,二抗类型,P27,L3,N2,N4,N18,N24,L4,一般单抗,0.560,0.160,0.230,0.162,0.071,