色谱法原理一课件

单击此处编辑母版样式,单击此处编辑幻灯片母版样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,Michael Tswett(1872-1919),a Russian botanist,discovered the basic principles of column chromatography.He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate.The various pigments separated into colored bands;hence the name chromatography,.,后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称一为,固定相,；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为,流动相,。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,在色谱发展史上占有重要地位的英国人,A.J.P.Martin(,马丁,),和,R.L.M.Synge(,辛格,),，他们,提出色谱塔板理论；发明液,-,液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。,1952,年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。,色谱法的优缺点：,分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化。,定性能力较差。,A.J.P.MARTIN,和,R.L.M.Synge,A.J.P.MARTIN,.,(1910-2002)of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R.L.M Synge the,Nobel Prize in Chemistry(1952)for the invention of partition chromatography,.,R.L.M.Synge,born Oct.28,1914,Liverpool,Eng.died Aug.18,1994,Norwich,Norfolk.,Synge studied at Winchester College,Cambridge,and received his Ph.D.at Trinity College there in 1941.,2.,色谱法的发展历史,3.,色谱法起过关键作用的,诺贝尔奖,研究工作,微观分离过程,色谱法分类,1,按两相状态分类,气体为流动相的色谱称为气相色谱,(GC,）。,根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱,（,GSC,）和气液色谱,(GLC,）。,液体为流动相的色谱称液相色谱,（,LC),。液相色谱又分为液固夜谱（,LSC,）,和液液色谱,（,LLC,）。,超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱,（,SFC,）,。,2.,按分离机理分类,利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为,吸附色谱法,。,利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为,分配色谱法,。,利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为,离子交换色谱法,。,利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为,凝胶色谱法,或,尺寸排阻色谱法,。,最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为,亲和色谱法,，常用于蛋白质的分离,。,3,按固定相的外形分类,固定相装于柱内的色谱法，称为,柱色谱,。固定相呈平板状的色谱法，称为,平板色谱,，它又可分为,薄层色谱,和,纸色谱,。,根据以上所述，将色谱法的分类总结于表,18-l,中。,2.2,色谱流出曲线及有关术语一流出曲线和色谱峰,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用,Gauss,正态分布函数表示：,式中：,C,不同时间,t,时某物质的浓度，,C,0,进样浓度，,t,r,保留时间，,标准偏差。,二、基线,是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图,18,3,中,Ot,线稳定的基线应该是一条水平直线,.,基线漂移 指基线随时间定向的缓慢变化。,基线噪音 指由各种因素所引起的基线起伏。,三、峰高,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图183中BA,四、保留值,1,死时间,t,M,不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图,18,3,中,OA,。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近。测定流动相平均线速,时，可用往长,L,与,t,M,的比值计算。,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图,18,3 OB,它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间,2保留时间t,R,3,调整保留时间,t,R,某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的,调整保留时间,，即,t,R,=t,R,-t,M,由于组份在色谱柱中的保留时间,t,R,包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以,t,R,实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如,s,）或距离单位（如,cm,）表示。,保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,4,死体积,V,M,指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速,F,0,（,L,min,）计算：,V,M,=t,M,F,0,5,保留体积,V,R,指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间,t,。的关系如下：,V,R,=t,R,F,0,6,调整保留体积,V,R,某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即,V,R,=V,R,-V,M,7,相对保留值,2.1,某组份,2,的,调整,保留值与组份,1,的,调整,保留值之比，称为相对保留值：,由于相对保留值只与,柱温,及,固定相的性质,有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据,必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.,8.,选择因子,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（,s,），然后再求其它峰（,i,）对这个峰的相对保留值此时，,r,i/s,可能大于,1,，也可能小于,1,在多元混合物分析中，通常选择,一对最难分离的物质对,，将它们的相对保留值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号,表示：,式中,t,R2,为后出峰的调整保留时间，所以这时,总是大于,1,的。,色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,1.,标准偏差,即,0.607,倍峰高处色谱峰宽的一半，如图,18,3,中,EF,距离的一半。,2.,半峰宽,W,1/2,即峰高一半处对应的峰宽，如图,18,3,中,GH,间的距离它与标准偏差,的关系是：,W,1/2,=2.354,五、区域宽度,即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中,IJ,的距离它与标准偏差。的关系是：,W=4,3.峰底宽度W,从色谱流出曲线上，得到信息是：,（,l,）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数,（,2,）根据色谱峰的保留值,(,或位置），可以进行定性分析,(3),根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析,（,4,）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据,（,5,）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相,(,和流动相,),选择是否合适的依据,2.3,色谱法分析的基本原理,色谱分析的目的是将样品中各组分彼此要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远,，,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关,。,但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。,这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。,因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,一、分配系数,K,和分配比,k,1,分配系数,K,如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,，即,2.,分配比,k,分配比又称,容量因子,，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即,k,值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称,分配容量或容量因子,。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。,k,值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅,随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积,有关。,式中,C,S,，,C,m,分别为组分在固定相和流动相的浓度；,V,m,为柱中流动相的体积，近似等于死体积。,V,s,为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，,V,s,表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。,滞留因子,R,s,分配比,k,值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为,u,，组分在柱内线速度为,u,s,，由于固定相对组分有保留作用，所以,u,s,u,此两速度之比称为滞留因子,Rs,。,R,s,若用质量分数表示，即,对组分和流动相通过长度为,L,的色谱柱，其所需时间分别为,整理公式，可得,3.,分配系数,K,与分配比,k,的关系,其中,称为,相比率,，它是反映各种色谱柱型及结构特点的又一个参数。例如，对填充柱，其,值一般为,6,35,；对毛细管柱，其,值为,60,600,。,4,分配系数,K,及分配比,k,与 选择因子,的关系,根据对以上公式处理，对,A,、,B,两组分的选择因子，可用下式表示,上式表明：,通过选择因子,把实验测量值,k,与热力学性质的分配系数,K,直接联系起来，,对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的,K,或,k,值相等，则,=1,，,两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。,两组分的,K,或,k,值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,最早由,Martin,等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用,精馏塔,中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,二 塔板理论,（,plate theory,）,该理论假定：,（,i,）在柱内一小段长度,H,内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度,H,。,（,ii,）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（,V,m,）。,（,iii,）所有组分开始时存在于第,0,号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。,（,iv,）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一 塔板上的量无关。,为简单起见，设色谱往由,5,块塔板（,n,5,，,n,为柱子的塔板数）组成，并以,r,表示塔板编号，,r=1,，,2,，,n,l,；某组分的分配比,k=1.,根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：,开始时