分子综合性实验论文终稿任佳

4编号辅以移产用需普成绩歹 Hubei Normal University生物学综合实验Comprehensive Experiment of Biology论文题目Pfu酶的表达，纯化及功能分析作者姓名任住学号 2010114010117所在院系 生命科学学院学科专业名称 生物科学导师 王友如论文完成时间 2013年03月02日Pfu酶的表达，纯化及其功能分析任佳指导老师：王友如（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石435002）摘要：目的：利用重组大肠杆菌 DH5a表达pfu酶，并对其功能进行分析。 方法：含pfu DNA聚合酶基因的重组大肠杆菌 DH5a。经1mM IPTGW导表 达10-12小时后，用超声波破壁，再用用 80C ,30min热变性去除部分杂蛋 白，粗酶7经Ni离子亲和层析进一步纯化。最后用 PCR检验酶的活性。结 果：获得了高纯度的重组pfu酶,并发现其具有较高的活性，利用该酶成功 扩增出VHB的DNA片段。关键词：pfu DNA聚合酶；IPTG诱导；纯化；活性。Expression ,purification and functionresearch of pfu DNA polymeraseRen JiaTutor: Wang Youru(College of Life Science , Hubei Normal University,Huangshi,HubeiProvince )Abstact: Aim : Express pfu DNA polymerase in E. Coli DH5 ,dhen purify it and research its function .Method: E. Coli DH5 a containing pfu DNA polymerases gene ,10-12h after 1mM IPTG addition ,were wall-broken by ultrasonic wave. The extraction were purified by heat treatment (80 C , 30min to denature E. Coli proteins), followed by metal-affinity chromatography on Ni2+-Sepharose columns. Conclude: We got pfu DNA polymerase after purification, then found that the enzymes were characterized and displayed high DNA polymerase activity. We use it successfully in amplification of VHB gene.Keywords: Pfu DNA polymerases； IPTG addition ; Purification ; Activity.Pfu DNA聚合酶是从超高温古生菌强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)中分离得到的，拥有3 -5外切酶活性，这使它在PCR扩增 过程中能够校正错误，是已知DNA聚合酶中出错率最低的，特别适用于需 要高保真度的PCR扩增1 ,被认为有潜力取代目前广泛使用的Taq酶。Pyrococcus fuiosus 最早是在意大利Vulcano地热海底沉淀物中发现的。 Pfu DNA聚合酶基因编码一个 775个氨基酸的多肽，分子量90 ,109D。这 种酶最初是直接从Pyrococcus fuiosus中分离得到的，但因这种极端嗜热氧厌氧菌很难培养，难以获取大量的酶。本项目通过修饰引物使Pfu基因末端引入His-tag编码序列，从已有Pfu基因的载体上把它克隆下来，重新 连接入更易表达的pET-28a载体中，并在大肠杆菌DH&中大量表达，通过 纯化使其与商用Pfu酶活性相当并对其功能做具体研究，发现其具有较高 的活性。1 .前言12材料与方法21.1 材料21.1.1 实验材料21.1.2 仪器设备21.1.3 试剂及溶液31.2 方法71.2.1 Pfu酶的表达 71.2.2 目的蛋白的纯化 103 结果与分析143.1 SDS-PAGE电泳结果分析 143.2 PCR结果分析144讨论165总结 .165.1 纯化过程中可能出现的问题 1 75.2 PCR过程中可能出现的问题176参考文献17致谢18湖北师范学院2012年生命科学学院本科综合性实验论文Pfu酶的表达，纯化及其功能分析 任佳 指导老师：王友如（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石 435002）1 .前言.Pfu 最初是直接从Pyrococcusfuriosus 中提取出来的2 3 ,但是这种嗜 热性厌氧菌很难生长到一定的规模而获得大量这种蛋白质酶，所以在杆菌 中表达重组的Pfu酶是一个较好的选择。Lu和Erickson 3利用pET载体， 成功的在大肠杆菌中表达出Pfu酶，并且可以轻易的进行毫克量的生产。Dabrowski4在酶的末端加上一个 His标签，然后用Ni2+亲和层析一步分离 提取出Pfu酶。Mathur已于1996年中请得到了生产重组 PfuDNA聚合酶的 专利。Pfu酶价格比Taq酶更昂贵一些。使用自制酶不仅能够更加方便的进 行实验研究，而且还可以节省一定的科研经费。通过简化纯化步骤，优化 工艺流程，则可以为商业化生产DNA聚合酶打下基础并提供借鉴，从而进一步降低DNAK合酶的生产成本，促进 DNAIK合酶更广泛的运用和推广。Pfu 酶是目前已知的保真性最好的 DNA合酶，被认为可能取代Taq酶。 Pfu酶扩增效率通常比T “l酶差，这是由于Pfu酶具有3-5的外切酶 活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu酶在扩 增2kb以下的DNAt段和Taq没有多大差别5。用Pfu酶扩增时，引物的 纯度要求较高，长度要求大于 18 base, Tm在55 80 之问。引物的浓度 在0.1-0. 5jM之间，比Taq酶略高。Pfu酶具有3 5的外切酶活性 可能会降解弓物，特别是溶液中没有dNTP的情况Pfu酶具有3w5的外切 酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，Pfu酶必须最后加入到反应体系中，并立即进行PCRK应。本次实验中我们利用重组大肠杆菌 DH5 a表达pfu酶，并对其功能进行 分析。方法：含pfu DNA聚合酶基因的重组大肠杆菌 DH5 a。经1mM IPTG 诱导表达10-12小时后，用超声波破壁，再用用80C,30min热变性去除部分 杂蛋白，粗酶7经Ni离子亲和层析进一步纯化。最后用PCR检验酶的活性。2 .材料与方法.2.1 材料2.1.1 1实验材料.含pfu DNA聚合酶基因的重组大肠杆菌 DH& , pfu DN咪合酶（宝生 物（大连）有限公司），DNA maker,蛋白质 maker（TIANGEN BIOTECH （BEIJING）CO.,LTD） , Ni-NTA 亲和层析介质，2.1.2 仪器设备.His-Tag亲和层析柱（17-5268-01型，飞羿科技）稳压稳流电泳仪（DYY-5型，北京市六一仪器厂）全温培养箱（HZQ-2金坛市医疗仪器厂）冷冻离心机（TGL-16LA, GL-2M型，湖南星科仪器有限公司）雪山制冰机（FM40ffl, YKKY超纯水机（AYJ1-0501-U型，艾科浦）节能型智能恒温槽（DH-2120型，宁波新芝生物科技有限股份公司）振荡培养箱（BS-1E型，江苏省金坛市亿通电子仪器厂）单人单面净化工作台（SW-CJ-1FCffi,苏州净化设备有限公司）高压灭菌锅（YXQ-LS-50S型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）PCRtZ （Biometra , German”凝胶紫外成像仪（GeneCompanyLimited）pH计（MT-8061型，深圳市卡迪亚科技有限公司电子天平（TE412-L, CP64型，德国Satorins 公司）超声波细胞粉碎机（XO-650型，南京先欧生物科技有限公司）水平摇床（WD-9405ES,沃德生物医学仪器公司）调温电热套（KOhfi,武汉精华科教仪器有限公司）2.1.3 试剂及溶液.活化、扩配、诱导、表达：LB液体培养基：药品成分质量g胰蛋白豚10酵母提取物5NaCl10加950 mL去离子水，用NaOHI pH 7.0 ,定容至1 L ,分装，121c 高压灭菌20 min ,冷却至50 C以下，加入 50 L Kana储液至终浓度为 50 pg/mL。（LE0体培养基：在100 ml LB液体培养基中，加入1.5 g琼脂 粉） 100 mg/ml Kana：Kana 0.4 g溶于4 ml无菌水中，-20 C冻存备用。1 mol/L IPTG贮存液：IPTG 0.18 g 溶于4 ml无菌水中，-20 C冻存备用。 50mM Ph=7.4 PBS, 500M NaCl 缓冲液。PAGEfe泳检测：15剂离胶：a.分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8): Tris- 碱 18.17g,溶于80 ml去离子水中，用浓盐酸调 pH至8.8 ,定容至100 ml。浓缩胶：b.浓缩胶缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8): Tris-碱 12.1 g,溶于50 ml去离子水中，用浓盐酸调 pH至6.8,定容至100 ml10%SDS在900 ml水中溶解100 g SDS加热至68c助溶，定容至1 L, 分装备用30殉烯酰胺(W/V):丙烯酰胺29 g , N,N-甲叉双丙烯吹胺1 g,加去 离子水60 ml ,加热溶解，定容至100 ml。用0.45um孔径滤器过滤， 溶液pH不大于7.0 ,棕色瓶4c保存。5X SDS电泳缓冲液：1L药品成分0.125M Tris1.25M Glycine0.5%(W/V) SDS质量g15. 1945.0加入约800ml的去离子水，搅拌溶解，加入去离子水定容至 1L后，室温保存。2XSDS上样缓冲液：药品成分体积ml0.5m mol/L Tris-HCI (pH 6.8)210 % SDS (W/V)1.250.5 % 澳酚蓝(W/V)0.2甘油2.5加入去离子水定容至9.5 ml，在使用前，加入 50 口 B-琉基乙醇 至U 9.5 ml上述溶液中，即为 2XSDS上样缓冲液。2XNon reduced SDS- PAGE Loading Buffer 用等量的蒸储水代替 B 一琉基乙醇即 可。 考马斯亮蓝R-250: 90 ml甲醇：H0 (1 : 1 v/v )和10 ml冰乙酸的混 和液中溶解，0.25g考马斯亮蓝R25Q用滤纸过滤除去颗粒状物质。 质量浓度10%t硫酸俊(AP):将1 g过硫酸氨溶解于10 ml的水中， 分装为小管，-20C保存。洗锲柱：2M盐酸孤 Stripping buffer:药品成分质量g20 mM Tris2.422500 mM NaCl29.2550 mM EDTA14.6125加入约800ml的去离子水，搅拌溶解，力口 HCl调pH 8.0。加入去离子 水定容至1L后，室温保存。 0.3M NaOH域者 1M NaOH) 5X binding buffe r：50 mM Tris6.055 g500 mM NaCl29.25 g加去离子水800 ml ,用盐酸调pH值至8.0,用去离子水定容至1 L 1.5 M NaCl :0.1M硫酸锲: 配咪坐：用1 x binding buffer 配透析液：每 100 mL Bingding Buffer 力口 70 ul 0-琉基乙醇。浓缩用试剂：PEG 8000琼脂糖凝胶电泳所用溶液及试剂:琼脂糖 50XTAE(Tris -乙酸)：药品成分质量g,/体积ml,Tris 碱24.2冰乙酸5.715mol/1 EDTA (pH 8.0)10加去离子水定容至100 ml ,使用时用去离子水稀释 50倍，即为工作液6 X上样缓冲液：2% (W/V)澳酚兰10 ml1% (W/V)蔗糖50 ml混匀后，加去离子水定容至100 ml ,分装，4c储存备用。5X TBE缓冲液1000ml (试剂组成：Tris Base ,硼酸和0.5M EDTA药品成分用量Tris Base54 g硼酸27.5 g0.5M EDTA (pH8.0)20 mL使用时，如果用于琼脂糖电泳，可以稀释 10倍，配成0.5 X使用。如果用 于PAGE配胶时加入量为1/5 (配10ml胶加入2ml),电泳可以使用0.5 X 的。 澳化乙锭EB贮存液：配制成10mg/mL的母液称取1.0g澳化乙锭，加入到200ml容器中。加入去离子水100ml, 充分搅拌数小时完全溶解澳化乙锭。.将溶液转入棕色瓶，室温避光 保存，用铝纸或黑纸包裹容器，贮存在室温，澳化乙锭最终工作浓度 为 0.5ug/ml。2.2 方法.2.2.1 Pfu 酶的表达。1 .活化菌种，.挑单菌落。取-20 C保存的冻存菌种 PET-28a-pfu （实验组）和DH5a（阴性对照组） 分别按1:100接入2支2ml的LB液体培养基中，实验组中按 1:1000的比 例加入100 mg/ml的Kana 2 ul ,于37c摇床中培养过夜。对已活化成功 的菌种进行涂平板，实验组中要加同样比例的Kana,对照组不加。涂平板要在超净工作台上进行，用灭菌后的接种环蘸取活化成功的菌液，在倒好 的平板上以“井”字形或“之”字形划线。划线完成后把平板用封口膜封 号，倒放于37c摇床中培养过夜，并做好标记。第二天来观察菌落的生长 情况，若可以观察到明显的单菌落，就在超净工作台上分别用灭菌的枪头 挑单菌落于2ml的LB液体培养基中重新活化，写好标记，实验组要加2ulKana。然后把试管放入37c摇床中培养过夜。这样就可以初步筛选目的菌。2 .用IPTG诱导。对已活化成功的菌种按1:50转接入新的5 ml的LB液体培养基中（剩 余的菌种保存在-4C）,实验组中按 1:1000的比例加入 100mg/ml的 Kana5ul,放入37c摇床中培,1-2小时，待ODfi为0.2左右时就利用IPTG 诱导，分别往各管中按1:1000的比例加入1M的IPTG5 ul ,诱导过夜（10-12 小时）。3 .全细胞电泳鉴定目的蛋白。将菌液分装于几个1.5 ml的EP管中，8000转离心5分钟，去上清， 加入25 ml无菌水和25ml 2 XSDS上样缓冲液，吹吸重悬，混合均匀。用 封口膜封好EP管管口，在沸水中煮10分钟，8000转离心5分钟后就可以 上样了。配置SDS-PAG也泳鉴定有无目的蛋白。a）安装双垂直板电泳槽；b）配12%勺分离胶15 mL,浓缩胶5 mL;SDS-PAG也泳的配方：表1 12%分离胶（15 mL成分体积（mD双蒸水1.630沏烯酰胺2. 01.5MTris-Hcl(PH8.8)1.310%硫酸俊（APs）0.0510%SDS0.05TEMED0.002体积(mD1.40.33表2 12%浓缩胶（5 mL）成分双蒸水30%5烯酰胺1.5MTris-Hcl(PH6.8)0.2510%t硫酸AP (APS)0.0210%SDS0.02TEMED0.002c）制样：取样品20 pL加样品缓冲液以20 pL混合，100 C加热5min, 15000X g, 4 c 离心 1 min ;d）上样：用微量注射器加样10-15pLe）电泳：在凝胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到160 V/cm继续电泳直到染料到达底部；f）固定和染色：用考马斯亮蓝 R- 250染色液浸泡，加热5 min；g）脱色：30 min更换一次脱色液，处理 3-5次，直到胶板呈现淡蓝2.2.2 目的蛋白的纯化。当电泳结果显示有目的蛋白时就可以把保留的菌种扩大培养进一步纯 化。取过夜菌按1:50转接入新的100ml的LB液体培养基中，实验组中按 1:1000的比例加入100mg/ml的Kana5ul,放入37c摇床中培,1-2 小时， 待ODfi为0.2左右时就利用IPTG诱导，分别往各管中按1:1000的比例力口 入1M的IPTG 5ul ,诱导过夜（10-12小时）。8000转离心5分钟得沉淀， 力口 PBS缓冲液（50 Mm, PH=7.4, 500 MnNaCl） 10ml.冰浴超生波破壁（处 理3次，每次30s,间隔30s）直到液体澄清为止。得到的细胞裂解液在80C 的恒温水浴箱中水浴30 min ,使杂蛋白变性失活。水浴后取上清，8000转 离心5分钟得上清。注意保留热处理及离心前后的样品以便于电泳分析。离心后的上清用锲柱纯化后，透析，浓缩，SDS-PAG睑验纯度。His-tagNi亲和层析法纯化融合蛋白预处理：a)用2M盐酸月瓜10 mL与树脂打散混合洗涤；b)用 StrippingBuffer 洗 20 min ；蒸储水洗 30 min ;c) 1.5 M 盐酸月瓜洗30 min ,蒸储水洗30 min ;d)用 1MNaOH1 1 h;用 BindingBuffer 洗 20 min；蒸储水洗 30 min； e)用 1.5 MNaCl洗 1 h；用 BindingBuffer 洗 20 min；蒸储水洗 30 min； f) Ni 柱再生：150mL0.1MNiSO酰，蒸储水洗,BindingBuffer 平衡。 平衡：6倍柱床体积BindingBuffer (pH=8.0)平衡。上样：把蛋白质上清接入 Ni柱进口端。洗脱：上样完后，继续用 BindingBuffer (pH=8.0)淋洗。之后开始用不同梯度的咪吵(50 mM 250 mM洗脱。对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。 蛋白质的SDS-PAG也泳检测方法同上。(8)透析a)处理透析袋：浸没在蒸储水中，加少许EDTA用蒸储水煮沸30 min； b)将蛋白样品转移到透析袋中，加入2-3滴琉基乙醇，浸入透析液中， 加转子，密封，在0-4 C下透析；c)透析2-3次，一次2-3个小时。(9)浓缩：用干燥的PEG800Cfe裹透析袋，在0-4 C下浓缩，以提高 浓度。2.2.3 用PCR检测酶活性。1 .PCR的原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现， DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。 因此，通过温度变化控制 DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入 DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制6 7 o标准的PCR过程分为三步：(1) . DNA变性(90 96 ):双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2) .退火(25 65 ):系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形 成局部双链。(3) .延伸(70 75 ):在耐热性DNA聚合酶(在72 左右最佳的活 性)的作用下，以dNTPs为原料，从引物的5 端 3 端延伸，合成与模板 互补的DNA链。2 .本实验中PCR扩增设计。19CK1 CK2加料 CK+ 1234567891016.16.16.16.15.15.16.16.15.15.双蒸水16.516.616.6Buffer2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0模板0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4P2引物0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4dNTPS0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4Pfu酶总体ul0.20.20.40.60.81.00.40.60.81.0商用20.020.20.20.20.20.20.20.20.20.0. 20.2商用20. 20.020.00加好后，混匀，稍加离心并标记。说明：-纯化后的pfu酶用量中为了精确的加入微量的pfu酶，2-6用的是0.2Xpfu酶，其他用的是pfu酶原液，上表中记录的是实际加入的体积。所以1-10实际加入IXpfu酶的体积分别为0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0-ul;3 . PCR反应条件94 C3 min58 C 30s-68 C 90s (45s)30 个循环68 C3 min10 C5min反应结束后取10 M用1.5%的琼脂糖电泳进行鉴定4 .琼脂糖电泳观察PCR结果。制备琼脂糖凝胶(1%)制备凝胶板加样？ 电泳 染色？结果观察。(1)制备凝胶和胶板：45ml(1 XTBE)+0.4g琼脂糖(三角瓶)，煮胶，溶解，冷却至60 C (不烫手)，倒板(4-6mm),室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。(2)加样：8 ul DNAMark (加在第一孔)每管20仙PCR产物+4屋10 x buffer,混匀(按PCR体系顺序每孔各加5 ul)。(3 )电泳：电压3-5V/cm,约80-90V,注意电极方向。(4 )染色：EB染色约15min。(5 )观察：紫外透射分析仪下观察。3结果与分析。3.1 纯化后的pfu酶的SDS-PAGE电泳图分析。含pfu DNA聚合酶基因的重组大肠杆菌 DH5 a。经1mM IPTG诱导表达 10-12小时后，用超声波破壁，再用用80C ,30min热变性去除部分杂蛋白，粗 酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化kDa 1234图1 pfu酶的纯化1、DH5-a菌液 2 、超声波破壁后菌液(A1+A2)3 、80 c水浴后的菌液 4 、纯Pfu酶液(作为 marker使用)由图1可以看出-空载DH5 a中pfu酶未表达，因为它没有导入控制 pfu酶 表达的基因；抗kana细胞破碎后的全细胞中pfu酶表达了，但含有较多的 杂蛋白；80 c水浴后的菌液中杂蛋白数量大大减少；-过锲柱纯化后的蛋白纯度已经很接近实验室中原来提取的纯pfu酶了，说明本实验中pfu酶纯化效果较好。3.2 Pfu酶纯化后的活性检测。用不同浓度的咪陛洗脱的蛋白洗脱液通过透析并浓缩后,用PCR检测纯化后的蛋白活性。将纯化后的蛋白直接用作PCR实验组中的DNA聚合酶，阳性对照组DNA聚合酶是商用Pfu酶，阴性对照组中未加模板质粒。整个 PCR结果如图所示1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14图2 PCR结果10.2-ul商用酶,未加模板；2-0.2-ul纯化后的酶，未加模板-3-12纯化后的 pfu 酶用量分别为 0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2, 0.40.6, 0.8, 1.0-ul;13商用 Pfu 酶；14DNAmarker ;由图2可以看出只有13-商用Pfu酶出现了扩增的目的片段，从 1 12都只出 现了大量的引物二聚体，而1,2的阴性对照正常，说明我们提纯的 Pfu酶失 活了。4 .讨论。就SDS-PAGE的结果来看，我们提纯的 pfu酶的纯度已经很接近纯的 pfu酶了,而且提纯的数量约有 20 ml,说明用锲柱的纯化效果比较好。就PCR的结果来看，我们提纯的 pfu酶已经失活。我们一共进行了 3 次PCR,第一次按总体积20 ul的体系把纯化好的pfu酶进行PCR,琼脂糖 凝胶电泳显示：阳性对照和阴性对照正常，实验组没出现扩增的目的片段。我们推测可能是pfu酶的浓度太低，于是我们加大 pfu酶的用量，把PCR 体系扩大为30ul的，重新PCR、电泳，结果这次连阳性对照都没有出现扩 增的目的片段，证明这次 PCR失败了，我们可能在阳性对照中漏加了某种 成分。第三次PCR,我们把纯化好的20 ml pfu酶重新透析过夜、浓缩成5 ml, 按总体积30 ul的体系进行扩增，结果类似于第一次PCR,说明PCR结果没有扩增出目的片段与pfu酶的浓度无关，可能是我们提纯的pfu酶已在操 作过程中失活。5 .总结。在这次长达半个月的实验中，我们小组的成员都投入了极大的热情参与进来，但由于对实验操作不是很熟悉也犯下了很多错误。但是不管怎样，在老师的耐心指导下，我们都有不同的收获，我觉得不光是实验方面的，更重要的是我们还学会了团结协作和获取知识的能力。下面我来总结一下整 个实验过程中可能出现的问题。5.1 纯化过程中可能出现的问题。一开始的pfu酶的表达那一环节由于实验操作不规范重复了2次；过锲柱时由于缺乏经验可能造成了 pfu酶的损失；所以整个实验持续了两周时间。 虽 然SDS-PAGE结果显示我们已经提出了较纯净的pfu酶，但可能由于时间太久了 pfu酶已经失活才造成PCR未出现扩增的条带。5.2 . PCR反应中可能出现的问题：假阴性:不出现扩增条带假阳性：空白对照出现目的扩增产物。原因：靶序列或扩增产物的交 叉污染出现非特异扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致， 或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：引物特异性差，模板、引物、Mg2+离子浓度过高，退火温度过低，及PCR循环次数过多。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非 特异性扩增出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯 样带。原因模板不纯，buffer不合适，dNTP、Mg2+浓度过高，退火 温度过低，循环次数过多引起。6参考文献。1 Cline J,Braman J C,Hogrefe H H. PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerase J . Nucleic Acids Res ,1996,24 ;3546-3551 .2 KellyS . Lundberg, Dan D. S., High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus, Gene., 1991, 108: 1-6.3 LuC . L . , EricksonH . E , Expression in Escherichia cold of thethermostable DNA polymerase from Pyrococcusfuriosus 【J】. ProteinExpression and Purification, 1997, 11: 1791844 Dabrowski S . , Kur J . Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant HisTagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei Jl. Protein Expression and Purification , 1998, 14: 131 138.5王会文，赵晓俞，静天玉.几种耐热 DNA聚合酶的比较【J】，生物 学杂质，2001, 18(3): 36 376谭骏，刘听.基因工程原理及实验技术操作，北京：科学技术文献出版社，19947吴乃虎.基因工程原理，北京：科学出版社， 1998致谢衷心地感谢王友如老师对本论文的精心指导，感谢他给我们这次机会 让我们自己动手发现问题解决问题。虽然我们一次次实验结果不理想，但 王老师及时给我们一些改进的建议，并鼓励我们多查阅资料，指导我们以 不同的手段尝试，直到达到满意的效果。感谢袁跃同学的悉心帮助，我们 在实验组很多不熟悉的问题都依靠他的经验和技能才的已解决。感谢我们 311实验室全体成员，是你们为我们营造了一个良好的实验环境，你们实验室那种团结友爱的氛围让我们觉得很温暖。