实验9-细胞培养和细胞融合(00001)课件

细胞培养和细胞融合,Email:,实验概要,实验目的,实验原理,实验操作,结果和分析,注意事项,思考题,实验目的,掌握,体外培养细胞的两种基本形态特征,。,掌握原代培养,和传代培养的基本方法和操作过程,。,掌握,细胞融合的原理及细胞融合的方法,。,了解,杂交瘤技术的原理。,第一部分 细胞培养和冻存,细胞系,(cell line,）：,由原代培养细胞经过传代培养所得到的细胞群。,有限细胞系（,finite cell line,）,:,生存或增值次数有限的细胞系,。,无限细胞系（,infinite cell line,）,：,可以无限增殖的细胞系，被称作。,亚系（,Subline,）,：由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系。,细胞株（,cell strain,）,：,由单一细胞（或具有相同遗传、形态、功能特质的细胞群）增殖而来并保持其同一特质的一群细胞，被称作细胞株。其中由单一细胞增殖而来的细胞株，也被称作克隆细胞株。,亚细胞株（,substrain,）,：,由某一细胞株而来，但与原细胞株有所不同的细胞株，被称作原细胞株亚细胞株。,生长方式：,贴附生长型,、,悬浮生长型,；,类型：,上皮细胞型（扁平多角形，圆形核）、,成纤维细胞型（梭形，椭圆形细胞核）、,多形细胞型，圆型（悬浮细胞）,2.,培养细胞的特性,培养皿,(dish),离心管,(tube),培养板,(plate),培养瓶,(flask),4.,细胞培养用液,细胞培养基（,Medium,）：,人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。,包括：天然培养基,合成培养基人工设计、,并由已知成分组成的培养基。,培养基，如,MEM,、,DMEM/F12,、,DMEM,、,RPMI1640,等。,灭菌,：指杀灭或去除物体上所有微生物的方法，包括抵抗力极强的细菌芽胞。,消毒,：指杀死物体上病原微生物的方法，芽胞或非病原微生物可能仍存活。用以消毒的药品称为消毒剂。,抑菌：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。,无菌,：指没有活菌的意思。防止细菌进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。,6.,细胞培养技术,原代培养技术（组织块法、消化培养法）；,传代培养技术,：,悬浮生长细胞：离心法，,1000,转,/,分，,5,分钟。,贴壁生长细胞：,酶消化法,。,酶的种类：胰蛋白酶、胃蛋白酶、胶原酶等,胰蛋白酶,是用得最多的。一般浓度在,0.25-0.5%,。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于,-20,度。,作用温度：,37,pH,：,8.0,酶的终止：,Ca2+,、,Mg2+,、血清。,液氮罐,(,Liquid,nitrogen,tank,),冰箱,(freezer),冻存管,(cryovials),冻存盒,(cell freezing container),实验操作,贴壁细胞的传代培养和冻存,贴壁生长细胞：,胰酶消化法（见实验指导）,吸掉培养液；,PBS,洗,2,次；,加,1ml,胰酶,，培养箱内消化,5,分钟；,加入,1ml,培养基终止胰酶；,将消化好的细胞吹打成悬液,；,离心法，,1000,转,/,分,，,5,分钟,；,a.,加入,2ml,细胞培养液，混,匀,，,1,：,2,或,1,：,3,传代培养。,b.,加入,1ml,冻存培养基，重悬，分装至冻存管内冻存。,冻存培养基：含终浓度,5-,10,%DMSO,的完全培养基。,第二部分 细胞融合,实验原理,细胞融合,，即在自然条件下或利用人工方法,(,生物的、物理的、化学的,),，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。,由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。,人工诱导细胞融合,主要包括,:,病毒和化学融合剂以及电融合和激光融合等方法。,聚乙二醇,(PEG),结构为：,HOH2(CH20CH2)nCH20H,，相对分子质量在,2006000,均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能,改变各类细胞的膜结构,，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。,细胞融合的应用,-,杂交瘤技术,复习：细胞计数,结果和分析,描述,Hela,细胞的生长状态，填写细胞培养记录表。,总结,实验过程，描述观察到的细胞融合,过程。,注意事项,注意无菌操作,细胞融合实验中，不要过早的融化,PEG,，融化后注意保温。,思考题,原代培养和传代培养有哪些区别？,怎样避免细胞污染？,