大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

,分子生物学,2008,实验,*,分子生物学,2008,实验,2010,实验九，十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的,mob,基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需,将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源,DNA,分子进入的细胞，称感受态细胞。,一,.,实验原理,1.,概念,感 受 态 细 胞,转化,(Transformation),是将外源,DNA,分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,转 化,转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,(R,M),它可以容忍外源,DNA,分子进入体内并稳定地遗传给后代。,受体细胞经过一些特殊方法,(,如电击法,CaCl,2,RbCl(KCl,),等化学试剂法,),的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源,DNA,分子进入的感受态细胞,(,Compenent,cells),。,进入受体细胞的,DNA,分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。,将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子,(,Transformant,即带有异源,DNA,分子的受体细胞,),。,转 化,转化过程,RbCl(KCl),法，,CaCl,2,法，电击感受态制备等,RbCl(KCl,),法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用,电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪,CaCl,2,法简便易行,，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积,15,的无菌甘油于,-70,以下保存半年，因此,CaCl,2,法使用更为广泛,.,常用的感受态细胞制备方法,CaCl,2,法是以,Mendel,和,Higa,（,1970,）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于,0,4,，,CaCl,2,低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的,DNA,形成抗,DNA,酶的羟基,-,钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经,42 90,秒热激处理，促进细胞吸收,DNA,混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（,Amp,r,）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含,Amp,的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。,CaCl,2,法制备感受态细胞原理,提高转化效率的几个因素,细胞生长状态和密度,质粒的质量和浓度,试剂的质量,防止杂菌和杂,DNA,的污染,细胞生长状态和密度,:,不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从,70,或,-20,甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的,OD,600,来控制。,DH5,菌株的,OD,600,为,0.5,时,细胞密度在,510,7,个,/ml,左右,(,不同的菌株情况有所不同,),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,提高转化效率的几个因素,质粒的质量和浓度,:,用于转化的质粒,DNA,应主要是超螺旋态,DNA(cccDNA,),。转化效率与外源,DNA,的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源,DNA,的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。,1ng,的,cccDNA,即可使,50l,的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA,溶液的体积不应超过感受态细胞体积的,5,。,提高转化效率的几个因素,试剂的质量,:,所用的试剂,如,CaCl,2,等均需是最高纯度的,(GR.,或,AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处,防止杂菌和杂,DNA,的污染：,整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip,头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、,DNA,酶或杂,DNA,所污染,否则均会影响转化效率或杂,DNA,的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,提高转化效率的几个因素,1,）材料,E.coli,DH5,菌株；,pBS,质粒、,1.5ml,离心管（又称,eppendorf,管）,Amp,；,2,）设备,恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，,eppendorf,管等。,二,.,材料，设备及试剂,0.1mol/L,的,CaCl,2,LB,液体培养基,LB,固体培养基,Amp,母液：氨苄青霉素,(,Ampicillin,Amp),母液：配成,100mg/ml,水溶液,-20,保存备用,3.,试 剂,三,.,操作步骤,本实验以,E.coli,DH5a,菌株为受体细胞,并用,CaCl,2,处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因,(Amp,r,),，可通过,Amp,抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含,Amp,的培养基上不能生长。能在,Amp,培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。,受体菌的培养,1),从,LB,平板上挑取新活化的,E.coli,DH5,单菌落,接种于,3-5ml LB,液体培养基中,37,180rpm,振荡培养过夜；,2),将该菌悬液以,1:30-100,的比例接种于,100ml LB,液体培养基中，,37,振荡培养,2,3,小时至,OD600,在,左右,;,3),无菌条件下取,1.5 ml,菌液到,eppendorf,管,中，冰浴,10min,，,4,8000rpm,离心,5min;,4),彻底,弃上清液，在冰浴上加入,500,ul,预冷的无菌,CaCl,2,(0.lmol/L),使细胞悬浮；,5),4,8000 rpm,离心,4min,，弃上清液,(4,5,步可重复,1-2,次）,;,6),用,100l,预冷的无菌,CaC1,2,(0.lmol/L),重新悬浮细胞，冰上备用；,注：如果需要保存，用,80ul,预冷的无菌,CaC12(O.lmol/L),和,20ul,无菌的,70%,甘油悬浮细胞，液氮冷激,10min,后，,-70,以下保存备用。,2.,转化,取,100l,感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入,10l,连接产物（或质粒,DNA,）,(,含量不超过,50ng,体积不超过,10l),，轻轻摇匀，冰上,30-40min,；,A.,质粒,DNA,组：,10l,pBS,质粒,DNA+100l,感受态细胞悬液,B.,空白对照组,:,10ul,无菌水,100l,感受态细胞悬液,42,水浴中热击,90,秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却,2min,；,向管中加入,400,L,LB,液体培养基,(,不含,Amp),，混匀后,37,，,180rpm,振荡培养,40min,，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因,(,Amp,r,),；,涂平板：将上述菌液摇匀后取,100ul,涂布于含,Amp,的筛选平板上，,在菌液完全被培养基吸收后,，,37,倒置培养皿培养,1216h,。,注意：,1,、含,Amp,的,LB,固体培养基的配制,:,将灭菌的,LB,固体培养基水浴溶解后冷却至,60,左右,加入,Amp,储存液,使终浓度为,50-100ug/ml,摇匀后倒平板；,2,、,1,小时空间：转化后温浴,45min,左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板,1.,感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？,2.,如阴性对照中长出菌，原因？,3.,还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？,四,.,问题与讨论,