基因工程的载体和工具酶

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节 基因工程的载体和工具酶,基因工程的工具酶,基因工程的载体,一 基因工程的载体,载体的功能及特征,质粒（,plasmid,）,噬菌体,DNA,1、载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（多克隆位点）,具有合适的筛选标记,2、质粒,质粒,：,是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，1kb-200kb。,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,以大肠杆菌的质粒为例：,质粒的可转移性,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,携带特殊的遗传标记,重要的大肠杆菌质粒载体,(Boyer),pBR322：,松弛型复制,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,Ori,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于基因克隆,pUC18/19：,正选择标记,lacZ,的显色原理,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,pUC18/19,X-gal,b-半乳糖苷酶的a-肽段,lacZ,MCS,Plac,根据蓝白斑选择转化子,质粒DNA的分离纯化,碱裂解法,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,沸水浴法,proteins,L-DNA,cccDNA,RNAs,ocDNA,cccDNA,L-DNA,1、用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,2、加NaOH,和,SDS,的混合溶液，去膜释放内含物；,3、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体,DNA,及大部分蛋白质；,4、离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；,5、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒,DNA；,6、用无,DNase,的,RNase,去除残余的,RNA（选择）。,碱裂解法：,2、噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,大肠杆菌的,l,噬菌体DNA,噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。,l,-DNA载体的构建：,缩短长度,野生型,l,-DNA,包装的上限为,51kb,，本身长度为,48.5kb,，只有当插入的外源,DNA,片段不大于,2.5kb时,，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型,l,-DNA,的长度，可以提高装载量。其实野生型,l,-DNA,上约有,40-50%,的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将,l,-DNA,分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,l,-DNA载体的构建,：,插入型载体,载体长度,37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,插入位点,插入片段,体外包装,体外包装,如：l,gt 系列载体,l,-DNA载体的构建：,取代型载体,(Blattener),最小装载长度,10 kb,载体长度,26 kb,最大装载长度,25 kb,插入片段,插入片段,体外包装,体外包装,如：,Charon 系列载体,l,-DNA载体的构建：,删除重复的酶切位点,野生型的,l,-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个。,为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一酶切位点。,l,-DNA载体的构建：,加装选择标记,与质粒不同，野生型l,-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装,选择标记是,l,-DNA克隆载体构建的重要内容,l,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,l,-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,。,l,-DNA,载体的装载能力为,25 kb,，远远大于质粒的装载量,。,l,-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。,l,-DNA作为载体的优点：,l,-DNA,重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了,l,噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,l,-DNA重组分子的体外包装：,3、柯斯质粒,柯斯质粒（cosmid）一类人工构建的含有,l,-DNA,cos,序列和质粒复制子的特殊类型的载体。,cos,ori,Ap,r,Tc,r,pHC79,l,fragment,能像,l,-DNA,那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。,能像质粒那样在受体细胞,中自主复制。,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围。,不能体内包装，不裂解,受体细胞。,考斯质粒载体的特点：,二 基因工程的工具酶,限制性内切酶,DNA,连接酶,其它酶类,1、限制性内切酶,限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异,核苷酸序列的DNA水解酶.例如:,Eco,R I 可以识别,5.G AATTC.3,3.CTTAA G.5 粘性末端,限制性内切核酸酶：,在特异位点上切割DNA分子,分三类，常用为类酶,识别序列呈回文对称,命名：酶来源的生物名称缩写,属名-种名-株名-发现次序,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III,Haemophilus influenzae,d,嗜血流感杆菌,d,株,5-,GAATTC,-,3,3-,CTTAAG,-5,5-,GTTAAC,-,3,3-,CAATTG,-5,EcoR,的识别序列,Hae,的识别序列,5,NNNNNNN,GAATTC,NNNNNNNN,3,3,NNNNNNN,CTTAAG,NNNNNNNN,5,5,NNNNN,G,3,NNNNN,CTTAAp,EcoR,的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTC,NNNNNN,3,G,NNNNNN,5,5,NNNNNN,GTTAAC,NNNNN,3,3,NNNNNN,CAATTG,NNNNN,5,5,NNNNN,GTT,pAAC,NNNNN,3,3,NNNNN,CAAp,TTG,NNNNN,5,Hae,的识别序列和酶切切口（平端）,限制性内切酶识别特定的,碱基序列,同裂酶（isoschizomers)：,指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。,同尾酶（isocaudamer）：,指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。,2、,连接酶（DNA ligase）,该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二酯键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。,DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,T4噬菌体,电镜下的噬菌体,T,4,-DNA连接酶：,T,4,-噬菌体,连接温度：,不高于粘性末端熔点温度（Tm）,15,：,15/6h；12/8h；8/12h；,连接方式：,相同粘性末端的连接,平头末端的连接,不同粘性末端的连接,人工粘性末端的连接,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,同聚物加尾连接,5,5,5,5,AAA,AAA,TTT,TTT,TdT酶,连接酶,人工接头连接,BamHI,BamH,I,BamHI,3、反转录酶（reverse transcriptase）,这类酶来自于反转录病毒，它可以为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。,4、DNA polI 及Klenow片段,该酶常用于制备探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nick translation）法制备的。,该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成、隐蔽末端的填平反应等。,Klenow片段：DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片段，小片段（36KD）具有5 3 核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3 5核酸外切酶的活性。,作业：,基因工程常用的载体有哪些？作为基因工程的载体，应具备什么特点？,基因工程常用工具酶有哪些？请举例说明。,