流式细胞学概述

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术,Flow Cytometry,FCM,基本概念,流式细胞仪（Flow Cytometer）,流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器，它是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。,基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）,FCM,是一种在功能水平上对单细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。,使制备合格的单细胞悬液高速流过一个光学或电子传导特别敏感区，产生一组光学和电子信号，这些信号代表着重要的生物学性质，并进行定量分析。,发展史,细胞计数的发展,流式细胞仪起源于对细胞计数自动化的研究。1934年 Moldvan首先报道了一种对流动的细胞进行技术的装置，检测红细胞或染色后的酵母菌在稳定的压力作用下流过显微镜载物台上的一个细玻璃管，每个通过显微镜视野的细胞可被光电装置纪录下来。现在，人们把这个试验看作进行流式细胞分析的第一次尝试。,对流动的细胞准确聚焦,维持压力的稳定以保证一定的流速,如何消除大细胞或聚集的细胞对玻璃管的阻塞,发展史,细胞计数的发展,如何消除大细胞或聚集的细胞对玻璃管的阻塞,1947年Gucker第一次采用了鞘流原理对气体中的微粒计数。,1953年Crosland-Taylor利用同一原理，设计了一种鞘流系统，配合光电技术对红细胞进行计数。他将待测细胞悬液缓慢注入一个快速流动的液流中，使该液流包绕在细胞悬液的外侧形成鞘流（sheath flow），而细胞悬液则始终处于轴流状态。这样，就可以用较粗的管道而是细胞悬液直径较小，避免了管道阻塞。,发展史,细胞计数的发展,Coulter 原理,1949年Coulter申请了一项对“流动的悬浮粒子计数”的专利，其基本原理是：将一个微孔两侧充满电解液，通电后会有电流从微孔中通过。在压力系统控制下，当细胞或颗粒流过微孔时，使得微孔截面积减小。由于细胞或颗粒的电阻与电解质相差很大，可以检测出微孔两侧电压变化的脉冲。现在所用的大多数血细胞计数仪都是基于这一原理。,根据Coulter原理，信号脉冲的幅度和宽度与细胞或颗粒的体积有关，这就能使我们区分大小不同的颗粒，从而对感兴趣的细胞或颗粒进行计数。,发展史,流式细胞仪的发展,1969年Van Dilla等在Los Alamos国家实验室研制出现代意义上的流式细胞仪，它以氩离子激光为光源，采用了鞘流技术，在设计上使液流、激发光束、检测光路三者相互垂直，通过对荧光强度的检测以确定细胞内DNA含量。,1972年Len Herzenberg等在斯坦福大学研制出一台荧光激活细胞分选仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS),它标志着流式细胞仪商品化时代的到来。,1975年Coulter公司推出了其流式细胞仪产品，该机是第一台可以进行双参数分析的分选仪器。,80年代初，Joe Gray博士等制造出一台可进行高速分选的流式细胞仪，其分选速度可达每秒25000个细胞以上，并将该机应用于人类基因组计划中对人类染色体的分析。,发展史,在进入20世纪80年代和90年代以来，流式细胞仪分为两大类：,1 台式机型：其特点为光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，又称为临床型仪器,2 大型机：其特点为可将实验者所感兴趣的细胞分选出来，并可将单个细胞或特定的细胞数分选到培养孔和板上，同时可选配多激光光源和多个波长光束，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，这类FCM仪器又称为科研型流式细胞仪，这类仪器操作复杂，价格昂贵，适用于科研单位,流式细胞仪结构,1.流动室及液流驱动系统。,2.激光光源及光束形成系统。,3.光学系统。(,透镜、滤光片、小孔，,聚焦光源，收集不同波长的荧光信号,),4.信号检测系统。(,光电倍增管（PMT）、,补偿电路。荧光信号转换为电信号，并,将信号放大,),5.数据储存.显示和分析系统。(计算机),6.细胞分选系统。,FCM技术特点,FCM与其他细胞分析技术相比有如下特点,1.高速度，每秒钟可检测1000-5000个细胞,2.高灵敏度，每个细胞只要带有1000-3000个荧 光分子就能被检,测出来，两个 细胞之间有5%荧光量的差别就可区别 出来。,FSC光散射的灵敏度为0.3um，分辨率2.0%。,3.高精度，在细胞悬液中测量细胞，比其它分析技术的分辩率高，,变异系数更小。,4.高纯度，分选细胞的纯度可达99%以上。,5.多参数，从一个细胞中同时检测多个参量。,6.在适当的条件下，可对活细胞进行分选。,FCM应用于生物医学的基本步骤,1 制备合格的单细胞悬液,2 对所研究的细胞生物化学成分进行特异,性荧光染色或标记，但对于单独光散射,测量则不需染色,3 流式细胞仪测定制备好的细胞悬液样品,4 进行定量分析，所测数据一般用计算机,自动化程序辅助分析,对定量分析的结果，进行解释其在生物,学方面意义,FCM的光信号检测,（一）分类,：,荧光信号,/,光散射信号,（二）定量测量,（三）定量分析的影响因素,FCM的光信号检测,（一）分类,：,荧光信号,/,光散射信号,。,散射光信号（包括衍射光.折射光）,a 前向角光散射（Forward Scatter,FSC）,小角度,散射，前向立体角大约为0.5-2.0，FSC与被测细胞的大,小/体积有关，确切的说与细胞直径密切相关。,b 侧向角光散射（Side Scatter,SSC）,与激光束正交,90度角的方向的光散射信号，SSC对细胞膜.胞质.细胞器和,核膜的折射光的测量总和，可提供有关细胞内精细结构和,颗粒性质的信息。,FCM的光信号检测,荧光信号,当激光光束激发被荧光染料标记的细胞时，就会产,生荧光，荧光信号包括两种，自发性荧光和受激发射,的标记荧光，这两种荧光信号代表了所研究的细胞参数,的存在与定量。,FCM的光信号检测,荧光信号,单克隆抗体标记荧光探针,理想的荧光探针应满足以下4个方面的要求：,1 要有尽可能高的光子产量，提高信号强度,2 对激发光有较强的吸收，从而降低背景噪音,3 激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的差,距，减少背景信号对荧光信号的干扰,4 易于与被标记的抗原、抗体或其他生物物质,结合而不会影响被标记物的特异性。,FCM的光信号检测,荧光信号,在进行双参数免疫荧光检测时,，,要符合如下要求,：,在两种以上免疫荧光染色时,，,该荧光染料可被单,一激发,，,可通过特殊分光器将发射光谱区分开,。,或用双激发光,，,通过发射光谱的不同,，,或发射光,与发射时间上的不同区分开,。,要求荧光染料不致于干扰被标记抗体的特异性。,FCM的光信号检测,核酸荧光染料：,以特异性荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞增殖状况分析。,DNA染料：PI、EB、DAPI、Hoechst33342,RNA染料：噻唑橙、丫啶橙,FCM的光信号检测,核酸荧光染料：,共价键结合：FITC、PE,嵌入结合：PI、EB,静电结合：丫啶橙,DNA染料：PI、EB、DAPI、Hoechst33342,RNA染料：噻唑橙、丫啶橙,FCM的光信号检测,（一）分类,：,荧光信号,/,光散射信号,（二）定量测量,（三）定量分析的影响因素,FCM的光信号检测,（二）定量测量,荧光的定量测量：,荧光是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受激后而发射的，荧光测量的理论依据为：以细胞DNA含量测量为例。,1DNA含量的多少与吸收荧光染料分子的多少成正比,2荧光强度与吸收荧光染料分子的多少成正比,3荧光强度与通道数（Number of Channel)成正比,4通道数与DNA含量成正比,FCM的光信号检测,散射光的定量测量：,细胞在液柱中与激光相交时会向空间360立体角所有方向散射光线，散射光的强弱与细胞的大小.形状.质膜和胞内折射有关，与收集散射光的方向有关，常使用的散射光有两个：即FSC和SSC。,可以应用散射光的信号对未染色的和未遭受损伤的活细胞进行分析和分选，这是散射光测量的一个特殊应用。,（一）分类,：,荧光信号,/,光散射信号,。,（二）定量测量,（三）定量分析的影响因素,FCM的光信号检测,FCM的光信号检测,（三）定量分析的影响因素,1.细胞的荧光染色:,如染液的浓度.时间温度.PH值.,细胞数的相对一致性等等。,2.激光源的稳定性:,要求光源的功率高，稳定性,好，光场分布一致，为保证荧光脉冲的呈单峰,的正态分布，激光的工作状态呈TEM00模式，,其光场为单一的高斯分布。,3.细胞流速的稳定性:,使,细胞通过激光区受照时,间一致，使液流时刻处于稳定的分层鞘流和流速。,4.细胞悬液样品的影响:,细胞碎片，团块，二连,体细胞等。,5.FCM仪器的分辨率:FCM的分辨率的高低是以,变异系数（CV值）的大小来描述，分辨率越,高，仪器的灵敏度越高。如果一个细胞群体大,小形状一致，荧光量一致，理想测量分布应该是,一个又窄又尖的峰位，数学上通常用高斯分布,或正态分布来描述。,FCM的光信号检测,为表示所测信号的集中程度，变异系数被引入，公式为CV=,/（表示峰分布的标准误差，是分布的均值），CV值愈小说明分布愈集中。,实际所测结果的CV值包括两部分，即仪器的CV值和样品的CV值。样品的CV值是样品所固有的，与样品的物理性质，生物学特性，化学性质有关，亦即样品的本身.固定方法.染料性质.,处理程序.染色的方法等，都能影响样品的CV值。仪器的CV值可以通过仪器校正来降低。具有较小CV值的仪器可能发现所测细胞的一些细节，当两个细胞群体的荧光量仅相差在5%时，如果CV值在5%，两个细胞群体就无法区分开来，当CV值小于3%以下时，两个细胞群体就可以分开。,FCM的光信号检测,FCM数据的分析,数据采集与存储格式,FCM所测试的参量是一组数据，在更为复杂的检测时，是以每个细胞对应的全部相关数据以列表或矩阵方式存贮，称为LISTMOGE方式，这样便于数据的显示和分析。,数据显示方式通常有:,一维显示(单参数组方图显示),二维显示(点阵图显示)，常用于双参数显示,等高线图显示（二维显示），用于双参数显示,立体显示（假三维显示），用于双参数显示,盒状显示（BOX DISPLAY），用于三参数显,云层状显示（CLOUD DISPLAY），用于三参数显示。,多维数据显示，由假三维立体图与单参数组方图同时显示在同一个图。,FCM数据的显示,图形分析与设门,流式细胞分析的目的是对我们感兴趣的细胞参数进行分析。其中，“设门”是流式细胞仪数据分析中最为独特的技术。,“设门”是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。“门”的形状可包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和四象限门。,FCM数据的显示,FCM数据的分析,DNA含量的定量分析,2.RNA含量的定量分析,3DNA细胞增殖周期的分析,4细胞增殖活性的分析,5免疫荧光参数的定量分析,FCM数据的分析,DNA含量的定量分析,DNA含量以DNA指数（DNA Index，DI)来表示，公式为,实验样品细胞G0/1峰的均道值,DI=-,正常细胞G0/1峰的均道值,FCM数据的分析,DNA含量的定量分析,2.RNA含量的定量分析,3DNA细胞增殖周期的分析,4细胞增殖活性的分析,5免疫荧光参数的定量分析,FCM数据的分析,RNA含量的定量分析,RNA含量=256道 最高细胞数（256 道 平均 道数）平均道数（10,-2,）,平均RNA指数（RNA Index,RI)=实验细胞平均道数 正常细胞平均道数,FCM数据的分析,DNA含量的定量分析,2.RNA含量的定量分析,3DNA细胞增殖周期的分析,4细胞增殖活性的分析,5免疫荧光参数的定量分析,FCM数据的分析,DNA细胞增殖周期的分析,由于DNA细胞周期各时相的计算是一个十分复杂的数学模型，通常要采用计算机软件程序来辅助完成,FC