医学感受态细胞的制备与质粒DNA的转化课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,转化,(Transformation),是将外源,DNA,分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,受体细胞经过一些特殊方法,(,如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl,),等化学试剂法,),的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源,DNA,分子进入的,感受态细胞,(Competent cells),。,将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子,(,Transformant,即带有异源,DNA,分子的受体细胞,),。,一、实验原理,感受态细胞的制备与质粒,DNA,的转化,所谓感受态,就是细菌吸收转化因子的生理状态。,关于感受态的本质与存在,说法很多,目前主要有两种假说,:,局部原生质体化假说感受态细胞的表面形成一种能接受的酶位点,使分子能进入细胞。,1,、感受态细胞的制备,CaCl2,法是以,Mendel,和,Higa(1970),的发现为基础,其基本原理是,:,细胞处于,0,4,CaCl2,低渗溶液中,大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的,DNA,形成抗,DNA,酶的羟基,-,钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经,42 90,秒热激处理,促进细胞吸收,DNA,混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型,如氨苄青霉素耐药,(,Amp r,),得到表达,然后将此细菌培养物涂在含,Amp,的选择性培养基上,倒置培养过夜,即可获得细菌菌落。,(,一,)CaCl,2,转化法,核心,:,目标细胞在,CaCl,2,H,2,O,溶液中浸泡一段时间,转化效率,10,7,-10,9,cell/,gD,。,NE.coli,: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105,(1),冰上,30min,(2),热激,42 90“,(3),恢复,1,2min,(4),复苏,37 45-60 min,(,二,),原生质体转化法,(protoplast),适用于,G,+,细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。过程,:(1),等渗环境下,脱细胞壁,(Lysozyme)(2),细胞壁再生,(,三,),电转化法,(electroporation),缓冲液,:10,甘油或蔗糖,含,(,或不含,),Mg,2+,离子。转化条件,:2.5,KV/0.2cm 25,F 200-400,。,分子转化分以下几步,:,吸附,双链分子吸附于受体菌表面,;,转入,双链分子解链。一条链进入受体菌,另一条降解,;,自稳,外源质粒分子在细胞内复制成双链,;,表达,一供体基因随同复制子同时复制,分裂,转录翻译。,2.,转化,这和受体菌,:,质粒的选择相关,原则上要注意,:,受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株,;, 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。,重组子的筛选方法常用的有两种方法,:,抗生素筛选法,互补法,3.,重组子的筛选,菌株为某种抗生缺陷型,而质粒上带有该抗性基因,(,如氨苄青霉素,卡拉霉素等,),这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。,本实验利用抗生筛选转化子。,抗生素筛选法,现在使用的许多载体,(,如系列,),有含有一个大肠杆菌的短区段,其中含有,半乳糖苷酸基因,(lacZ),的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。,受体菌则含编码,半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时,二者溶为一体后,有,半乳糖苷酶表达,在生色底物溴氯吲哚,半乳糖苷,(x-gal),培养基中形成兰色菌落。,而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失活,而使,lacZ,基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,、互补法,菌种,:E,. coli,DH5a(,空,),、,E. coli,K12(,空,),设备,:eppendorf,管、微量取液器,(,20l,200l,1000l),台式高速离心机,涡旋振荡器,试剂,:LB,液体培养基 、,0.1mol/L CaCl,2,、,Amp,二、材料、设备及试剂,一、感受态细胞的制备,(,一,),、受体菌的培养,(,二,),、感受态细胞的制备,( CaCl2,法,),1,、将,1.5ml(,每人,),培养液转入离心管中,于,4,下,3000g,离心,10,分钟。,2,、弃去上清,用预冷的,0.1mol/L,的,CaCl,2,溶液,1ml,轻轻悬浮细胞,冰上放置,15-30,分钟后,4,下,3000g,离心,10,分钟。,3,、弃去上清,加入,200,l,预冷的,0.1mol/L,的,CaCl,2,溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。,4,、 感受态细胞分装成,200l,的小份,贮存于,-70,可保存半年。,二、 转化,1,、取,200l,感受态细胞悬液置冰上。,2,、加入,1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置,30,分钟后。,3,、,42,水浴中热击,2min,热击后迅速置于冰上冷却,3-5,分钟。,4,、向管中加入,1ml LB,液体培养基,混匀后,37,振荡培养,45min-1,小时,。,5,、,将上述菌液摇匀后取,200l,涂布于含,Amp,的筛选平板上,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37,培养,16-24,小时。,对照,:,另取未转化感受态细胞分别涂布,筛选平板,(Amp,终浓度,50ug/ml),和,空白平板,实验结果,:,下次实验观察并分析筛选结果,四、注意事项,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素,:,1.,细胞生长状态和密度,:,不要用经过多次转接或储于的培养菌,最好从,70,或,-20,甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的,OD600,来控制。,DH5,菌株的,OD600,为,0.5,时,细胞密度在,510,7,个,/ml,左右,(,不同的菌株情况有所不同,),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,四、注意事项,2.,质粒的质量和浓度,:,用于转化的质粒,DNA,应主要是超螺旋态,DNA(cccDNA,),。,转化效率与外源,DNA,的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源,DNA,的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。,1ng,的,cccDNA,即可使,50l,的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA,溶液的体积不应超过感受态细胞体积的,5,。,四、注意事项,3.,试剂的质量,:,所用的试剂,如,CaCl2,等均需是最高纯度的,(GR.,或,AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。,4.,防止杂菌和杂,DNA,的污染,:,整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管, tip,头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、,DNA,酶或杂,DNA,所污染,否则均会影响转化效率或杂,DNA,的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,感受态细胞低效,抗生素使用错误,转化后立即涂板忘记温浴,使用高效率的感受态细胞,(10,6,以上,),复查质粒抗性,使用正确的抗生素,转化后温浴,45min,左右,让抗性基因得以表达,。,五、质粒,DNA,转化常见问题,问题一,:,转化后无克隆产生,原因,对,策,未加,IPTG/X-Gal,或其失效,抗生素失活,敏感菌亦能生长,用于制备感受态的菌株退化,丢失了某些重要因子,检查平板是否含有,IPTG/X-Gal,以及是否新鲜,如平板有问题,重新制备新鲜平板,复查抗生素的抗性,用于制备感受态的菌株,传代次数不能太多,(20,代以内为佳,),五、质粒,DNA,转化常见问题,问题二,:,实验组只有,白色,菌落,(,没有蓝色,菌落,),原因,对,策,1.,感受态细胞有何特点,?,如何保证它的质量,?,2.,如阴性对照中长出菌,原因,?,3.,还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞,?,各有什么优缺点,?,六、问题与讨论,如果转化成功,由于质粒,DNA,上带有,Amp,抗性基因导致本来,Amp,敏感的菌株也可以在含有,Amp,的,LB,固体培养基上生长,如图,1,。如转化不成功则,Amp,敏感的菌株和阴性对照不会在含有,Amp,的,LB,固体培养基上生长,如图,2,。,图,1,图,2,，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，中医长期停滞不前、疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、,砼幻靼祝瘟剖艿街圃迹谛,SARS,、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车，风马牛不相及，从理论上讲就没薪岷系目赡埽皇切问缴系娜诤前存在于中西医学甚至人文社会科学史上一切疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切赡涯：侍猓匀灰淹耆隽酥形饕窖婕暗姆冻耄颐潜匦胩鲋形饕窖,睦砺劭蚣埽鹨桓鲂碌囊窖,砺厶逑,-,东方医学和西方医学（即西医）的融合形成现代系统医学。该体系所涉及的一切问题不管从广度上，还是从深度上，都应该远远超过现有的中西医学理论，并将现有中西医学理论纳入自己的理论框架范围之内。为了肩负起这一历史使命，原创人生、医学理论体系,灵魂医学,soul medicine,应运而生，她不但从宏观上或战略上圆满解释并解决了存在于人类医学及人文社会科学史上的一切疑难模糊问题，而且还能够使人们得以启迪人生，不得不重新认识人类自身、不得不重新认识人类赖以生存的这个多维世界对象的医学科学，故不能解现今医学分为传统医学、基于“生物,-,医学模式”近代发展起来的西医，,20,世纪西医又发展到“社会,-,心理,-,生物医学”或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、华中科技大学、郑州大学等学校。 中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人们与疾病长期斗争的经验总结。习樟恕食鱿治饕蕉灾瘟撇涣说募膊缓们笾幸剑幸皆蛲捎梦饕秸锒现幸街瘟疲约爸形髦瘟品豢橛玫木置妗 至于循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完整性的瑕疵，即都是以不完整的人为研究及阴阳五行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论体系。它为人类尤其为中国人民健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学决目,医学健康系列精品课件,珍爱生命 关注健康,本文档下载后可以修改编辑，欢迎下载收藏。,