毛细管等电聚焦

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Capillary Iso-Electric Focusing(CIEF),毛细管等电聚焦,等电点，pI,正负电荷相等时对应的pH,两性离子,细胞色素C10.6,胰蛋白酶原9.2,鲸肌红蛋白7.6,马肌红蛋白6.6,Beta-乳球蛋白 5.2,转铁蛋白 4.3,pI7的蛋白质在不同pH处的荷电情况,等电聚焦的原理,具有一定pI的蛋白在电场中建立的pH梯度介质中，当所处位置的pH低于pI时带正电荷，向负极移动；在高于pI的pH位置时带负电，向正极移动；在等于pI处不动。不同等电点组分被聚焦在不同位置而达到聚焦和分离的目的。,C,apillary,I,so-,E,lectric,F,ocusing-,CIEF,高分辨率（分辨率可达0.005 pH）,快速,微量,在柱检测,如何在电场方向上产生pH梯度？,如何维持建立的pH梯度的稳定？,毛细管中pH梯度的建立,CH,2,=CH,COOH,CH,2,=CH,NH,2,(CH,2,-CH),m,NH,2,(CH,2,-CH),n,COOH,丙烯酸,乙烯氨,聚两性电解质,两性电解质的合成,0,+,-,pH/,x,阳极端(酸性电解质）,阴极端（碱性电解质）,两性电解质的电荷与pH的关系,0,+,-,pH/,x,阳极端,阴极端,pI,两性电解质中的蛋白,CIEF操作过程,CIEF分辨能力取决于：,扩散系数,电场强度,pH梯度,淌度的pH梯度,CIEF 中的谱带移动,正极移动：在正极加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动,负极移动：在负极，加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动,压力移动，加电压的同时施加压力，实现移动的同时保持聚焦状态,扫描检测分离谱带，无需谱带移动,x,pH,阴极端,阳极端,阳极移动示意图，阳极加入中性盐,x,pH,阴极端,阳极端,阴极移动示意图，阴极加入中性盐,CIEF中加电加压转移方法,CIEF分离蛋白混合物,CIEF Analysis of anti-CEA MAb,CIEF测定等电点,CIEF蛋白定量分析,CIEF分析过程：载入，聚焦，迁移（检测）,CIEF试验要点,内壁经处理的毛细管,两性电解质（1）和样品充入毛细管,电极液20 mM 磷酸为阳极液，20 mM NaOH为阴极液,加电压聚焦，46kV，聚焦稳态后电流下降到起始的1025,聚焦区带的转移和检测,操作注意事项,浓缩沉淀：,由于局部高度浓缩，有可能导致蛋白沉淀阻塞。需要加添加剂，如PVA等对蛋白质pI影响小的非离子表面活性剂。,检测：,因为通常所用两性电解质在低UV有吸收，因此UV检测通常在较高波长，即280 nm进行。,比较,CEIF,CZE,原理,电解质,等电点,两性电解质,淌度,缓冲溶液,区带宽度,随时间变窄,随时间变宽,进样方法,混合在支持电解质中,塞状进样,区带浓度,被浓缩,被稀释,CIEF和CZE比较,