杨荣武生物化学第七章-核酸的性质及研究方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 核酸的性质及研究方法,提要,一、核酸的理化性质,二、核酸研究的技术和方法,核酸的化学合成,核酸的分离、纯化和定量,三、核酸一级结构的测定,DNA,一级结构的测定,RNA,一级结构,的测定,紫外吸收,酸碱解离,变性,复性和杂交,核酸的理化性质,DNA,的变性和复性,定义：是指核酸受到加热、极端的,pH,或离子强度降低等因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成单链的过程。其中并不涉及共价键断裂。,表征：核酸在变性时，紫外吸收和浮力密度升高，黏度降低，生物活性不变、降低或丧失，其中紫外吸收增加的现象称为增色效应。,Tm,：双链,DNA,热变性是在很窄的温度内发生的，与晶体在熔点时突然熔化的情形相似，因此,DNA,也具有“熔点”，用,Tm,表示。,Tm,实际是,DNA,的双螺旋有一半发生热变性时相应的温度。,DNA,的,Tm,值受到,DNA,的均一性、,G-C,含量、离子强度和特殊的化学试剂的影响。,变性,GC,含量对,DNA Tm,的影响,DNA,分子中的,GC,含量与,DNA Tm,之间的关系曲线,核酸变性在一定条件下也是可逆的。当各种变性因素不复存在的时候，变性时解开的互补单链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性。热变性,DNA,一般经缓慢冷却后即可复性，此过程被称为退火。,伴随着,DNA,复性的是其浮力密度和紫外吸收的减少、粘度的增加和生物活性的恢复，其中紫外吸收减少的现象被称为减色效应。,影响,DNA,复性的因素有温度、离子强度、,DNA,浓度和,DNA,序列的复杂度等。,复性,DNA,的复性历程,不同,DNA,的复性动力学曲线,酸水解,核酸分子内的糖苷键和磷酸二酯键对酸的敏感性不同：糖苷键磷酸酯键；而嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键,碱水解,RNA,的磷酸二酯键对碱异常敏感，得到,2-,或,3-,核苷酸的混合物；,DNA,对碱的作用并不敏感，其抗碱水解的生理意义在于作为遗传物质的,DNA,应更稳定，不易水解。而,RNA,（主要是,mRNA,）是,DNA,的信使，完成任务后应该迅速降解。,酶促水解,核酸的水解,不同性质的核酸酶（,Pu,表示嘌呤，,Py,表示嘧啶）,核酸的抽取,两种核蛋白的分离,蛋白质的去除,核酸的沉淀,电泳,离心,层析,核酸的纯度的检测和定量,核酸的分离、纯化和定量,Sanger,发明的末端终止法或双脱氧法,Maxam,和,Gilbert,发明的化学断裂法,焦磷酸测序与深度测序,DNA,一级结构的测定,原理：,ddNTP,参入可导致,DNA,复制的末端终止,步骤,：,进行四组平行反应,每一组反应混合物含有四种,ddNTP,每一组反应含有一种少量的,ddNTP,在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，,DNA,合成正常延伸,有时，聚合酶使用,ddNTP,，而导致末端终止,每一组反应中,ddNTP,的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的,DNA,链。,对每一组反应混合物走凝胶电泳,片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部,从凝胶的底部向上读出序列,将读出的序列转化成互补链的序列,末端终止法,末端终止法图解,DNA,自动分析仪的组成,原理：是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（,32,P,）标记的单链,DNA,或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链,DNA,片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖,-,磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的,DNA,链降解产物，经聚丙烯凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测,DNA,片段的核苷酸序列。,步骤：进行四组平行的反应,G,特异性剪切,在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（,DMS,）处理，然后再使用哌啶处理。,嘌呤碱基特异性剪切,DNA,先进行酸处理，然后再加,DMS,。,嘧啶碱基特异性剪切,先用肼处理，然后用哌啶处理。,C,特异性剪切,在高盐下，先用肼处理，然后用哌啶处理。,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较,G,、,A,G,、,C,T,和,C,各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出,DNA,序列,。,化学断裂法,化学断裂法测定,DNA,一级结构的原理,焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由,4,种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种,dNTP,，若该,dNTP,与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的,3,端并释放出等量,PP,i,。,PP,i,可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种,dNTP,，继续下一轮,DNA,链的合成。,焦磷酸测序,除了焦磷酸测序法，近几年来，科学家还发明了一些新的测序方法，例如单分子测序法（,single-molecule sequencing,）。建立在这些新的测序方法基础之上的高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑，该技术可以对数百万个,DNA,分子同时进行测序，操作极为简便，大大节约了成本和时间。这使得对一个物种基因组和转录组进行细致全面的分析成为可能，因此也称其为深度测序（,deep sequencing,）,深度测序,测定,RNA,一级结构的主要方法有：,先使用逆转录酶将待测,RNA,逆转录成,cDNA,，然后再使用末端终止法等进行测定；,用化学或,/,和酶学方法对放射性同位素标记的,RNA,进行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；,质谱法,RNA,一级结构的测定,