樟树籽蛋白质的提取与分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,樟树籽蛋白质的提取与分析,08,生物 林开鹏,指导老师：李卫林,目录,前言,材料与方法,结果与讨论,结论,前言,1,樟树籽简介,1,）外形,樟树籽,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形,直径大约,5,9mm ,每千粒重大约是,200 g,果皮肉质薄,能散发出芬芳的清香,2,）药理作用,樟树籽有驱风散寒、行气止痛之功效。癸酸,(C10),已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药,主要含有癸酸,(C10),的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂,用于治疗脂肪代谢紊乱病症,并能降血脂及胆固醇。,材料与方法,材料,樟树籽干燥,70,摄氏度,24,小时，备用,试剂,石油醚（,C.P.,，沸程,30,60,），磷酸氢二钠（分析纯,AR,），磷酸二氢钠（分析纯,AR,）， 氯化钠（分析纯,AR,），,95%,乙醇（分析纯,AR,），,Tris,（分析纯,AR,），浓盐酸（分析纯,AR,） ，,SDS,（分析纯,AR,），甘油（分析纯,AR,），溴酚蓝（分析纯,AR,），,-,丙烯酰胺（分析纯,AR,），巯基乙醇（分析纯,AR,），甲醇（分析纯,AR,），考马斯亮蓝,R-250,（分析纯,AR,），冰醋酸（分析纯,AR,）,器材,FZ102,型植物粉碎机，索氏提取器，离心机，紫外分光光度计，垂直电泳槽，电泳仪，微型凝胶电泳装置（厂家）；水浴锅；,Eppendorf,管；微量注射器（,50l,或,100l,）。,实验,提取方法,1,）称样,取,10g,样品装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死；防止样品泄出滤纸斗。调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处,2,）虹吸 向提取管中倒入石油醚，使其液面达到第一次液面的一半，冷凝管与自来水管相连轻轻打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪整个装置放入恒温水浴锅中加热提取（水温,80,左右）提取时间,2,2h,，约虹吸,10,次以上,3,）回收,取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会虹吸而流入回收瓶中，达到回收的目的。再装上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。注意：必须蒸干后才能放入干燥箱烘干，否则会引起火灾。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚,4,）称量粗脂质量将平底烧瓶放入,120,的电热鼓风干燥箱中烘,15min,，取出冷却后称重（须戴手套，以免烫伤）。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净，于,120,的电热鼓风干燥箱中烘干（约,15min,），取出冷却后称重，两者的质量之差就是粗脂的质量。,5,）蛋白质的溶解 将上述去脂烘干的样品置于烧杯中，加入,ph,为,7.2,的磷酸盐缓冲夜,100ml,浸提,2h,蛋白质的分离方法,1,将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同，对称放入离心机中，调整离心机,4000,转,5,分钟，将上清液倾入烧杯，加晶体,NaCl,少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入,95%,的乙醇,100ml,混匀。观察有无沉淀析出,2,将所得溶液离心，获得沉淀，用,1% NaCl,溶液溶解定容于,250ml,容量瓶中，备用。,蛋白质的定性,1,茚三酮反应,取,1,支试管加入蛋白质溶液,1,毫升，再加,0.5,毫升,0.1,茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热,12,分钟，观察颜色,在一小块滤纸上滴一滴,0.5,的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴,0.1,的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察,2,黄色反应,取一试管，置所提取的蛋白质溶液,10,滴及浓硝酸,34,滴，加热，冷却后再,10%NaOH,溶液,5,滴，观察颜色变化,蛋白质的等电点,实验步骤：,取同样规格的试营,4,支,向以上试管中各加 样品蛋白的醋酸钠溶液,1,毫升,加一管,摇句一管,.,此时,1,2,3,4,管的,pH,值依次为,1,3,5,7,观察其混浊度,.,静置,10,分钟后,再观察其混浊度,.,最混浊的一管的,pH,即为样品蛋白的等电点,.,紫外光吸收法测定蛋白质浓度,在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得,280nm,和,260nm,两种波长的吸光度（,A280nm,及,A260nm,）。,将,A280nm,及,A260nm,波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度,。,C,= 1.45,A,280nm,0.74,A,260nm,式中,C,：蛋白质质量浓度（,mg/ml,）；,A,280nm,：蛋白质溶液在,280nm,处测得的吸光度；,A,260nm,：蛋白质溶液在,260nm,处测得的吸光,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,蛋白质的分子量测定,实验试剂配制,灌制分离胶,电泳,制备样品和上样,.,灌制浓缩胶,考马斯亮蓝染色,结果与讨论,前处理,粉碎后用烘箱对樟树籽进行干燥时，粉末热时湿度较大冷时结冻成固态，可以体现樟树籽中油脂含量较高，,称量樟树籽,10.002g,索氏抽提得到蛋白和淀粉的混合物重,7.623g,，计算油脂的含量粗脂的含量（,%,）,=2.377,10.002*100%=23.765%,蛋白质的提取,乙醇沉淀蛋白法等 本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性,尽可能减少杂质。本实验采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质再用,乙醇为脱水剂破坏蛋白质胶体质点的水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取，提取效果好，提取率,蛋白质的颜色反应是检验蛋白质方法简单方便，提取的物质在,黄色反应中呈黄，茚三酮反应呈紫红色,，充分证明所提取的物质为蛋白质。,根据蛋白质等电点的测定最终测定蛋白质的在,PH,为,1,时沉淀最为明显,所以提取的该蛋白质的等电点为,1,紫外光吸收法测定蛋白质浓度方法简单方便测得蛋白质的浓度：,计算结果,: C = 1.45A280nm,0.74A260nm=3.177mg,ml,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,经过电泳操作得到出产品的图谱，分离胶的浓度为,7.5%,，浓缩胶的浓度为,5%,。,图,1,电泳图谱（,7.5%,分离胶，,5%,浓缩胶）,图,2,电泳图谱（,10%,分离胶，,5%,浓缩胶,）,电泳结论,从图中可以看出，当分离胶的浓度采用,7.5%,时，分离效果比较差，而且泳道中蛋白样品有拖尾现象，因此调整分离胶的浓度。,从图,2,可看出，样品,1,和样品,2,中蛋白质组分得到较好的分离，出现比较明显的条带，中间所加标准品的量太少，没有显示出条带。从这次的实验结果可知，樟树籽中蛋白质的分子量大约在,30,200 kdal,之间。,结论,通过实验可以得到以下结论：,通过对樟树籽脱脂，然后采用稀盐溶液所得产品通过茚三酮反应证明是蛋白质，采用醇溶法提取的产品也用该方法证明是蛋白质。提取的蛋白质浓度分别为：,1 3 5 7 9 11 13,，等电点为,1,。,经过初步的,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，结果表明提取所得蛋白质的相对分子质量大约在,30,200kdal,范围内。,谢谢,