小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验,武汉大学基础医学院,免疫学教研室,熊 洁,原 理（体外法）,巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物,(,鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等,),共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。,本实验拟检测小鼠腹腔巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬功能。,材 料,1,小白鼠,2,白色念珠菌液（美兰染液着色）,3,6,可溶性淀粉肉汤,肉汤培养液,100 m1,，加入可溶性淀粉,6g,，混匀后煮沸灭菌,4,小鼠解剖器械、显微镜、离心机、温箱等,5,试管、吸管、微量加样器、计数板,方 法,(1),、小鼠巨噬细胞制备,实验前三天每只小鼠腹腔注射,1,可溶性淀粉,1ml,。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡,5,分钟。,剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口,(,注意避开血管,),，用,1640,灌注腹腔，收集腹腔液于试管中,(,约,4 ml),，,1500 r/min,，离心,10 min,，去上清，沉积细胞用,1640,离洗一次。最后沉积细胞用含,10,小牛血清,1640,配成适当浓度备用,(1-2106,ml),。,（,2,）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养,48,小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，,100,，煮沸,30 min,灭活，离心去掉上清，再用,1,美兰染色,30 min,，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成,110,8,ml,菌悬液，,4,冰箱保存备用。,（,3,）吞噬细胞与菌混合培养,取巨噬细胞,0.5ml,加白色念珠菌悬液,0.5ml,，置,37,温育,30min,。,取,1,滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数。,高倍镜下观察计算：,吞噬率,=(,吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数,/100,个巨噬,细胞,)100,吞噬指数,=100,个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数,/100,个巨噬细胞,*,(,吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞,),注 意 事 项,1,、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌与吞噬细胞之比,10,：,1,时吞噬作用容易观察和计数。但是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比例为,1,：,1,。,2,、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过,30 min,，如果在,37,C,条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解，也就不能计数为吞噬了菌的细胞。,3,、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞数就相应的少一点。,血球计数板计数法,血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出,9,个大方格（见下图），每格面积,1mm,2,，加盖玻片后的深度为,0.1mm,。因此，每大方格容积为,0.1mm,3,。,四角的大方格，又分为,16,个中方格，适用于白细胞计数。中央大方格以双线等分为,25,个中方格。每个中方格又分,16,个小方格，通常我们取四角的,4,个中方格和中间的,1,个中方格来计数红细胞。,首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。,计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应重复,3,次，取其平均值。,数完毕后，依下式计算：,每,1mL,白细胞悬液细胞数（,4,个中方格细胞总数,/4,）,10,4,稀释倍数,每,1mL,红细胞悬液细胞数（,80,个小方格细胞总数,/80,）,40010,4,稀释倍数,