酶活力测定及酶的分离纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（一）,酶的活力测定,酶活力,是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可以用在一定条件下所催化的某一反应的反应速度来表示，两者呈线性关系。,10 20 30 40 50 60 min,产物生成量,酶反应进程曲线,酶的活力测定和分离纯化,用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度.,测定酶活的方法：,终点法: 测定完成一定量反应所用时间。,动力学法:测定一定时间所起的化学反应量。,（二）酶活力的测定方法,1.分光光度法,利用,底物和产物,在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。,优点：,简便、节省时间和样品，可检测到,nmol/L,水平的变化。,2.荧光法,主要是根据,底物或产物,的荧光性质的差别来进行测定。,3.同位素测定方法,4.电化学方法,酶活力的表示方法,活力单位,（active unit）,习惯单位（,U,）,:,底物(或产物)变化量,/,单位时间,国际单位（,IU,）,:,1,moL,变化量,/,分钟,Katal（,Kat,）：,1,moL,变化量,/,秒,比活力,=,总活力单位,总蛋白mg数,=,U(或IU) mg蛋白,量度酶催化能力大小,转换系数,（,Kcat,）,底物（,moL）,/,秒每个酶分子,量度酶纯度,比活力,（specific activity）,量度转换效率,酶的分离提纯,1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.,2、基本操作程序：,选材,抽提,分离,纯化,微生物、动物、植物,加入提取液抽提,胞内酶先破碎,先净化处理,再沉淀法分离,离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等,酶的保存：,1.低温（0-4)；2.高浓度较稳定；,3.加入稳定剂； 4.固定化。,酶的固定化,就是把水溶性酶经,物理（吸附法与包埋法）,或,化学方法（共价偶联法与交联法）,处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,1、吸附法：,使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。,2、包埋法：,使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,3、偶联法：,使酶通过,共价键,连接于适当的不溶于水的载体上。,4、交联法：,使酶分子依靠,双功能基团试剂,交联聚合成“网状”结构。,酶制剂纯度的主要指标是：,A.蛋白质的浓度,B.酶的总量,C.酶的总活性,D.酶的比活性,D,下列哪项条件适合保存酶制剂？,A.0闭光,B.室温闭光,C.-20 闭光,D.室温光照,A,作 业,P107思考题,1、5、6、7,第七节,酶工程简介,一、酶工程的概念:,酶工程,：是指,酶制剂,在工业上的大规模生产及应用。,1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：,酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。,天然酶在开发和应用方面受到限制：,1.酶的不稳定性,2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵,目前在酶的应用方面所采取的一般方法：,1.,化学方法,：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。,2. 利用,基因重组技术,生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。,二、化学酶工程,化学酶工程亦称初级酶工程,：,指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。,1.天然酶,主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。,2.化学修饰酶,：,用于医药及研究工作，通过,（1）化学修饰酶的功能基 ；,（2）通过交联反应；,（3）大分子修饰作用,3.固定化酶,：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。,4.人工模拟酶,化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）,。,三、生物酶工程,生物酶工程的主要内容：,克隆酶,用基因工程技术大量生产酶（,-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）,突变酶,对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶,制造新酶,设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶,生物酶工程亦称高级酶工程,是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。,四、抗体酶,抗体酶,指专一于抗原分子的， 具有催化活性的,免疫球蛋白,，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。,（五）核酶,1.概念,核酶：,具有催化活性的RNA.,2.种类,按作用底物分：,（1）催化,分子内反应,（如,自我剪接,和,自我剪切,）的核酶。,（2）催化,分子间反应,（如原核生物RNaseP中的RNA）的核酶。,本章内容结束，谢谢！,