沉淀与离心部分

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节 酶的分离方法,一、沉淀分离,二、离心分离,三、过滤与膜分离,四、层析分离,五、电泳分离,六、萃取分离,沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的,溶解度降低,，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,原理：根据不同物质在溶剂中的,溶解度不同,而达到分离的目的。,不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间,亲和力的差异,而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的,化学性质及结构,有关。,一、沉淀分离,沉淀分离方法,适用分子,盐析沉淀法,多用于各种蛋白质和酶的分离纯化,等电点沉淀法,用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，单独应用较少，常与其它方法结合使用,有机溶剂沉淀法,多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化,复合沉淀法,发展较快的新方法,选择性变性沉淀法,多用于除去某些不耐热的和在一定,pH,值下易变性的杂蛋白,常用的几种沉淀分离方法,1,、盐析沉淀法,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为,盐析现象,。,优点：,成本低，不需要特别昂贵的设备,操作简单、安全,对许多生物活性物质具有稳定作用,（,1,）基本原理,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中,以硫酸铵最为常用,。,（,2,）中性盐的选择,溶解度大,：硫酸铵在,0,时仍 有,70.6%,（质量分数）的溶解度，远远高于其它盐类。,盐类,0,20,80,100,硫酸铵,70.6,75.4,95.3,103,硫酸钠,4.9,18.9,43.3,42.2,硫酸二氢钠,1.6,7.8,93.8,101,几种盐在不同温度下的溶解度（,g/100ml,水）,分离效果好,：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可能除去,75%,的杂蛋白，纯度提高了,4,倍。,不易引起变性，有稳定酶的作用,：有些酶用,2-3mol/L,的硫酸铵保存可达数年之久。,价格便宜，废液不污染环境,（,3,）盐析的操作方法,最常用的是固体硫酸铵加入法。,研磨硫酸铵成细粉,边搅拌边缓慢均匀少量多次加入,冰浴,离心,过滤,加盐速度尽量慢，避免局部硫酸铵浓度过大而造成蛋白质变性,低浓度,高浓度,（,4,）盐析的影响因素,蛋白质浓度,：,2.5%-3.0%,（质量分数）较适中，相当于,25-30 mg/ml,pH,值,：常选在该酶的等电点附近,温度,：对温度敏感的酶，要求在,0-4,下操作，以避免活力丧失,盐析时注意事项：,酶不同，结构不同，所需盐浓度不同。另外，酶的来源，杂质等也对其有影响。,盐析后的酶含大量盐分，要进行脱盐处理,2,、有机溶剂沉淀法,原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。,优点：,分辩能力比盐析高,沉淀不用脱盐,缺点：,对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,（,1,）有机溶剂的选择和浓度计算,原则：能与水互溶,常用试剂：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸等常用的是乙醇）,计算公式：,V=V,0,(S,2,-S,1,)/(100-S,2,),需要加入量,原溶液体积,原溶液中有机溶剂的体积,有机溶剂终体积,加入有机溶剂的体积分数（纯溶液体积分数为,100%,）,（,2,）有机溶剂沉淀的影响因素,温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。,注意！大多数酶在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性！,样品浓度：通常使用,5-20mg/ml,的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的分离效果。,pH,值：选在等电点附件，提高分辩能力,离子强度：不超过,5%,为宜。乙醇溶液不超过原溶液,2,倍体积为宜。,离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同,分子大小、密度,的物质分离的技术。,二、离心分离,1,、基本原理,F=m,2,r,当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。,2,、相对离心力,RCF,就是实际离心力转化为重力加速度的倍数,RCF=F,离心力,/F,重力,=m,2,r/mg=,2,r/g,g,为重力加速度（,980.7cm/sec,2,),RCF= 1.11910,-5,(r/min),2,r,3,、离心机的主要构造和类型,（,1,）制备性离心机分为三类：,A,、普通离心机,最大转速,6000r/min,左右，最大相对离心力近,6000g,，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质。,Eg,：红细胞、酵母细胞等。,B,、高速冷冻离心机,最大转速为,20000-25000r/min,，最大相对离心力为,89000,g,，最大容量可通到,3L,，分离形式也是固液沉降分离。,一般有制冷系统，离心室温度可调节和维持在,0-4,，转速、温度和时间都可严格控制。,C,、超速离心机,转速可达,50000-80000r/min,，,相对离心力最大可达,510000,g,名称,最大转速（,r/min,）,相对离心力（,RCF,）,特点,常速离心机,6000,6000 g,主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离,。,高速离心机,（,1,2.5,）,10,4,110,4,110,5,g,主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。,超速离心机,(2.5,12)10,4,510,5,g,主要用于,DNA,、,RNA,、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。,（,2,）转子,转子类型,固定角式转子,(fixed-angle rotor),水平转子,(swing-out rotor),垂直转子,(vertical rotor),带状转子,(zonal rotor),连续转子,(continuous rotor),转子的材质,铝质：较轻,耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用,;,不锈钢：耐受强度最好,但材质本身太重；,钛合金：耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。,A,、固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在,14-40,之间。 常见的角度,20 28 34 40,角式转子的特点,重心低,转速可较高,样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径,“,管壁效应,”,：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。,设,40000rpm,时,R1,最小、,3.8cm,R2,平均、,5.9cm,R3,最大、,8.1cm,RCF,值分别,67,910g,105,400g,144,700g,R1,R2,R3,在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其,RCF,值也各不相同,B,、水平转子 （,1,）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行,（,2,）转子旋转加速时,离心管中心线由 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成,90,角,（,3,）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的“管壁效应”,水平转子的特点,转子的重心位置较高,样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径,对于多种成分样品分离特别有效,常用于速率区带离心和等密度离心,3,、离心方法,（,1,）差速沉降离心法,分离两种以上大小，密度不同的颗粒。,操作方法：,分离较大颗粒 分离较小颗粒,适用范围：大小、密度相差较大的颗粒,优点：操作简单、方便,缺点：分离效果差，沉淀中有杂质，沉淀后颗粒在底部易受挤压,上清加大转速和分离时间,例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份,已破碎的细胞,500g,10,分钟,沉淀 上清液,(,细胞核）,10,000g,10,分钟,沉淀 上清液,(,细胞膜碎片,线粒体,) 100,000g,3,小时,溶酶体,沉淀 上清液,(,核糖核蛋白体）,(,可溶性成份,),（,2,）差速区带离心法（密度梯度离心）,样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数不同的颗粒相互分离的方法,介质：梯度介质形成梯度范围，不与样品反应，不使样品凝集、变性或失活。,常用：蔗糖,浓度：,5%-60%,；密度：,1.02g/cm,3,-1.28kg/cm,3,操作方法：,加样,离心,收集,小心放在梯度溶液表面,不同颗粒形成若干条带,虹吸或切割离心管等方法,（,3,）等密度离心,分离密度不同的颗粒，在离心力作用下上浮或下沉。,常用介质：铯盐。如,CsCl,、,Cs,2,SO,4,等,操作方法：,混匀样品与介质,离心,分离,4,、离心机操作注意事项,必须事先在天平上精密的平衡离心管和其内容物。,依据不同离心液体选择不同离心管，每次检查转头,低于室温离心时，要先将转头预冷,离心过程中不得随意离开,了解转头最高离心转速和使用积累限时。,