DNA复制、转录和翻译复习

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞与分子诊断系,严永敏,分子诊断学,内 容 提 要,分子诊断学,是供高等医学检验专业本科学生使用的教材，也可供其他医学相关专业学生及医生参考。,本书主要内容分为以下几个方面：,（,1,）基础篇：,着重描述了原核生物基因组、病毒基因组、真核基因组和蛋白质组等基础理论；,（,2,）技术篇：,介绍了生物大分子的分离纯化技术、分子克隆技术、,DNA,测序技术、,PCR,技术、核酸分子杂交技术、蛋白质组研究技术和生物芯片技术等；,（,3,）应用篇：,在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、多基因疾病的分子诊断、移植配型、法医学鉴定、单核苷酸多肽型分析以及生物信息学在分子诊断中的应用。,实验,1,分子生物学基本操作与训练,；,实验,2,感受态细胞的制备，,重组质粒导入大肠杆菌及重组子筛选,；,实验,3,重组质粒,DNA,的小量制备；,实验,4,重组质粒,DNA,限制性内切酶的酶切与鉴定,；,实验,5,聚合酶链反应（,PCR,）及琼脂糖凝胶电泳；,实验,6,基因组,DNA,的提取与鉴定；,相关实验课程,复习,DNA,的复制、转录和翻译,基因表达调控,DNA,复制,概念,:,半保留复制,半不连续复制,(,前导链,后随链,),冈崎片段,DNA,复制的酶学,DNA,聚合酶,(DDDP,多功能酶,),起始阶段,-,获得单链模板,解螺旋酶,拓扑异构酶,单链结合蛋白等,反,转录,(,r,everse transcription,),以,RNA,为模板，合成与其互补的,DNA,的过程,也称,逆转录,。,RNA,DNA,反,转录,酶,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性（,RDDP,）。,核糖核酸酶,H,活性（,RNaseH,）。,DNA,聚合酶活性（,DDDP,）。,反转录酶的作用合成,cDNA,：,反转录酶,（,reverse transcriptase,）,是依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，它以,RNA,为模板，,4,种,dNTP,为底物，催化合成,DNA,，此过程称为反转录过程。反转录酶是,多功能酶,。,5,3,3,5,RNA,(,用 表示,),RNA,-,DNA,杂化分子,3,5,RNase,（,核酸酶,H,活性,),DDDP,（,DNA,聚合酶活性）,4,种,dNTP,RDDP,（,反转录酶,）,引物、,4,种,dNTP,病毒双链,DNA,用 表示）,（,cDNA,第二链,(complementary DNA,，,cDNA,),与病毒,RNA,互补的,DNA,(,用 表示,),5,3,3,5,5,3,5,3,反转录酶的作用,转录,(,transcription,),生物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过程,转录,RNA,DNA,转,录,的,条 件,：,原料,:,4,种,NTP,(,A,TP,UTP,G,TP,C,TP),模板,:,单链,DNA,酶,:,RNA,聚合酶,其他蛋白质因子,复制与转录的异同,?,？,转录起始,RNA,聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域,;,DNA,双链解开，使其中的一条链作为转录的模板,需解决,两个问题,：,模板和,RNA,聚合酶的辨认、结合,5,3,3,5,结构基因,调控序列,RNA-pol,启动子（,promoter,),RNA,聚合酶识别,结合并起始转录的一段高度保守性,DNA,序列，称为,保守序列,（一致性序列）,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35,区,(Pribnow box),结合部位,，,影响启动子复合物形成,；,T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10,区,1,-30,-5 0,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,识别部位,，,还决定启动子强度,；,原核生物启动子,（,Sextama,框）,间隔区,原核生物的转录起始,2,DNA,双链解开,形成,转录空泡,1,RNA,聚合酶全酶,(,2),与模板结合,3,在,RNA,聚合酶作用下,发生第一次聚合反应,5-,ppp,Gp,N,OH+,ppi,RNApol-DNA-pppGpN-OH,ppp,G,NTP,ppp,GpN-,OH,ppi,起始复合物,:,5-,ppp,G-,OH,+,NTP,5,3,DNA,原核生物转录过程中的现象,核糖体,RNA,RNA,聚合酶,转录终止,-,RNA,聚合酶在,DNA,模板上停止前进，,转录产物,RNA,链从转录复合物上脱落下来,原核生物的转录终止子（,terminator,）,1,、,依赖,因子（,Rho),的转录终止,2,、不依赖,因子,的转录终止,DNA,模板上靠近终止处，有些,特殊的碱基序列,，转录出,RNA,后，,RNA,产物形成,特殊的结构,来终止转录。,TTG,CAGCCTGA,CAAA,TCAGGCTG,ATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT,DNA,或,UUUU,CAAUCAA,茎环结构,RNA,5pppG,5,3,3,5,茎环结构使转录终止：,1,，,使,RNA,聚合酶变构,2,，使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放,RNA-pol,真核生物的转录起始,也需要,RNA,聚合酶辨认、结合转录起点,，生成起始复合物。,-GCGC-CAAT-TATA,转录起始,TATA,盒（,-30,-25,）,CAAT,盒,(-75),G C,盒,(-90),基 因,增强子,(enhancer,),增强转录效率,RNA,聚合酶,II,启动子,D,TATA,A,B,DNA,TATA,F,E,RNA,聚合酶与模板,DNA,的结合需一系列,转录因子,(TF),的参与。,RNA,聚合酶,真核生物的转录终止,和转录后加工密切相关,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,Poly,(,A,),mRNA,核酸酶,-GUGUGUG,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,RNA-pol,真核生物的转录后加工,内含子（,intron,）和外显子（,exon,）,蛋白质的生物合成,翻译,翻译（,translation,）,是指以新生的,mRNA,为模板，把核苷酸的三联体遗传密码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。,蛋白质生物合成体系,模板：,mRNA,原料：,20,种编码氨基酸,氨基酸运载体：,tRNA,场所：核蛋白体,酶：氨基酰,-tRNA,合成酶、转肽酶,蛋白质因子：起始因子（,initiation factors,IF;eIF,）,延长因子（,elongation factors,EF,）,释放因子（,release factors,RF,）,核蛋白体释放因子（,ribosomal release factors,RRF,）,一、,mRNA,是翻译的直接模板,开放阅读框架（,open reading frame,ORF,）,mRNA,从,5,3,方向，从起始密码到终止密码的序列，称为一个开放阅读框架。,遗传密码（,genetic,codon,）,开放阅读框架内每,3,个碱基组成的三联体，决定一个氨基酸，称为遗传密码。,遗传密码的特点,（一）遗传密码的连续性（,commaless,）,（二）简并性（,degeneracy,）,（三）摆动性（,wobble,）,（四）通用性（,universal,）,（五）偏爱性,AUG,UGA,UAA,UAG,二、核蛋白体是肽链合成的场所,核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的蛋白质和,rRNA,，原核生物和真核生物又各有不同。,SD序列（Shine-Dalgarno),原核生物特有的、位于,mRNA,上,起始密码子,上游的一段富含,嘌呤（,AGGA),碱基的短序列，是,mRNA,与,核糖体小亚基结合位点,，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点（,ribosomal binding site,，,RBS,）。,。,基因表达调控（,control of,gene expression,）,基因表达的开启或关闭以及基因活性的增加或减弱等，受着调节和控制。,基因表达,(,gene expression,),-,通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后直接产生,RNA,产物的过程。,基因表达调控,顺式作用元件,（,cis-acting element,）,特异,DNA,序列,可调节转录的,DNA,片段。,非编码序列；包括启动子、增强子、终止子、沉默子等。,反式作用因子,（,trans-acting factor,）,蛋白质,与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转录活性的蛋白质因子,。,包括转录因子，,RNA,聚合酶等。,反式作用因子,（,trans-acting factor,）,激活蛋白,(activator protein,）,促进转录；,阻遏蛋白,(repressor protein),抑制转录；,RNA,聚合酶,直接识别并结合启动子，解开,DNA,双螺旋，催化合成转录产物；,第二节 原核生物基因转录调节,原核基因转录调节特点,操纵子模型的普遍性,操纵子,一个转录单位,RNA,聚合酶对转录起始的调节,调节蛋白对转录起始的调节,操纵子（,operon,）：,原核生物的一段,DNA,序列，由几个串联排列的功能相关的,结构基因,，加上,调控序列,组成的一个完整的连续的功能单位。,乳糖操纵子,P,：启动子,O,：操纵基因,Z,：,-,半乳糖苷酶基因,Y,：通透酶基因,A,：乙酰基转移酶基因,结构基因,调控序列,细菌对乳糖的利用及其相关的酶,:,乳糖,(,在通透酶作用下进入细菌内,）,半乳糖苷酶,（细菌中少量存在）,异乳糖,半乳糖苷酶,（细菌中少量存在）,葡萄糖,+,半乳糖,半乳糖苷酶 （细菌中少量存在）,转乙酰基酶,-,乙酰,半乳糖,乳糖操纵子,细菌以,葡萄糖,为能量来源,葡萄糖充分时（,优先利用,）：,与,葡萄糖,代谢,有关的酶基因,-,表达,与,其他糖代谢,有关的酶基因,-,关闭,葡萄糖耗尽,时，乳糖存在：,与,乳糖代谢,有关的酶基因,-,表达,与,葡萄糖代谢,有关的酶基因,-,关闭,阻遏蛋白的,负,调控,(,negative,control of repressor,),无乳糖,(no lactose):,lac,操纵子处于,阻遏状态,(repression),乳糖代谢基因表达调控图解：,(,没有乳糖时,),I,lac,Z,lac,Y,lac,A,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA,聚合酶,mRNA,转录,翻译,阻遏蛋白与操纵基因,结合，结,构基因转,录受阻,阻遏蛋白,有乳糖,(presence of lactose),lac,操纵子被,诱导,(derepression,induction),诱导剂,(inducer):,异乳糖、半乳糖、,IPTG,（异丙基硫代半乳糖苷）,1,、半乳糖的正调控,乳糖代谢基因表达调控图解：,(,有乳糖时,),I,lac,Z,lac,Y,lac,A,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA,聚合酶,mRNA,转录,翻译,阻遏蛋白与别乳糖结合后构象发生了改变，,因而不能与操纵基因结合，使得结构,基因进行转录。,阻遏蛋白,别乳糖,转录,半乳糖苷酶,通透酶,乙酰转移酶,CAP,的,正,调控（,Positive,Control of CAP,）,CAP(catabolite activator protein),分解代谢基因激活蛋白,同二聚体,(,亚基,22kD),，是一种重要转录调节蛋白。,两个结合位点,DNA,结合域,cAMP(cyclic AMP),结合位点,2,、,乳糖操纵子,(,lac,operon),的调控方式,协调调节,(coordinate regulation),负调控与正调控协调合作,阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,不发挥作用,如没有,CAP,加强转录，即使阻遏蛋白从,O,上解聚仍无转录活性,葡萄糖,/,乳糖共同存在时，细菌优先利用葡