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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,综合化学实验,配位化学和生物无机化学部分,切割,DNA,的金属配合物,指导教师：,毛宗万,黄华珍,cesmzw,huanghuazhen,中山大学化学与化学工程学院,2009,年,10,月,缺刻型,DNA,线型,DNA,自由基机理,自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏,酯水解机理,亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应,酯水解机理优于自由基机理,DNA,结构及其断裂方式,配合物与未受损的,DNA,表面结合并诱导其断裂,进一步在新的断裂处结合,断裂反应,互补链的断裂,DNA,的自由基断裂,实验背景,模拟博莱霉素,在天然物质中，由,5,个氨基酸、,2,个六碳糖和,1,个氨基侧链构成的博来霉素（,bleomycin,）可导致,DNA,链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。,导致,DNA,链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致,DNA,链断裂的自由基。,CuP-3A,的配位结构示意图,博莱霉素的活性中心,Pamatong,F.V.;,Detmer,.C.A.,III;,Bocarsly,J.R.;,J.Am.Chem.Soc.,1996,118,5339.,Detmer,.C.A.,III;,Pamatong,F.V.;,Bocarsly,J.R.;,Inorg,.Chem.,1996,21,6292.,博莱霉素的模型化合物,Cu,2+,+e-=Cu,+,Cu,+,+H,2,O,2,=Cu,2+,+OH,-,+,OH,氨基酸铜化合物的合成路线,模板反应的化学机理,化合物,1,的红外光谱,(COO,-,),(COO,-,),(NO,2,),(NO,2,),化合物,2,的红外光谱,(COO,-,),(COO,-,),(NH,2,),氢氧自由基的形成和,UV,光谱检测,由于罗丹明,B,可与,HO,迅速反应，并在,553nm,有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验,HO,的生成。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法,琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物,根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖,低熔点琼脂糖熔点为,62,65,，溶解后在,37,下维持液体状态约数小时，主要用于,DNA,片段的回收，质粒与外源性,DNA,的快速连接等,凝胶浓度选择,琼脂糖凝胶的浓度与,DNA,分离范围,琼脂糖浓度,(%),线型,DNA,分子的分离范围,(,Kb,),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.9,6,1.5,0.2,3,12.0,0.1,2,电泳缓冲液,常用三种缓冲液,Tris,-,硼酸,(TBE),、,Tris,-,乙酸,(TAE),、,Tris,-,磷酸,(TPE),TBE,与,TPE,：,缓冲容量高，,DNA,分离效果好，但,TPE,在,DNA,片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使,DNA,沉淀,TAE,：,缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用,TAE,。,缓冲液中的,EDTA,可螯合二价阳离子，从而抑制,DNA,酶的活性，防止,PCR,扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂：溴酚兰、二甲苯青,溴酚兰,：,在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性,DNA,片段,二甲苯青：,水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性,DNA,大致相当,琼脂糖凝胶浓度,0.6%,1%,1.4%,2%,迁移率,1Kb,0.6Kb,0.2Kb,0.15Kb,琼脂糖凝胶浓度,1%,1.4%,迁移率,2Kb,1.6Kb,核酸电泳的染色剂,溴化乙锭,一种荧光染料，,EB,分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光,可在凝胶电泳液中加入终浓度为,0.5ug/ml,的,EB,，,有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色,10,15min,琼脂糖凝胶,EB,染色，肉眼可见核酸电泳带，其,DNA,量一般,5ng,溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡,30min,后再观察,ethidium,bromide,，,EB,电泳实验装置,电泳仪（普通）,电泳槽（水平平板）,灌胶模具等,电泳实验方法,洗净电泳槽，架好梳子,配制琼脂糖凝胶及倒胶,上样与通电,结果观察,配制琼脂糖凝胶及倒胶,0.5,TBE,电泳缓冲液,100ml,于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至,60(,需要时可加入,EB),，倒入电泳槽中，待凝固。,向电泳槽中倒入,0.5,TBE,，其量以没过胶面,2mm,为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）,上样与通电,在,DNA,样品中加入,0.2,体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内,接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记,DNA,样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为,1 5V/cm,（长度以两个电极之间的距离计算）,根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般 电泳条件为：电压,90V,，时间,40min,。,结果观察和记录,紫外仪上观察电泳带及其位置,拍照,进一步使用软件对光密度进行分析,DNA,断裂的凝胶电泳图,超螺旋,DNA ,缺刻型,DNA ,线型,DNA,合成实验要点,检查回流装置是否保持干燥,硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液,合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，亮蓝色或紫蓝色为反应正常,实验中化合物合成,与,DNA,断裂实验需交叉进行，,DNA,断裂所需的配合物由准备室提供,若硝基还原使用了较多溶剂,，需使用旋转蒸发器除去多余溶剂,凝胶电泳照相需戴手套,模板合成,大环化合物的合成方法（,218,室）,旋转蒸发器,除去多余溶剂（,218,室）,红外光谱,化合物结构表征（,201,室）,紫外可见光谱,跟踪,罗丹明,B,与氢氧自由基的反应（,204,室）,凝胶电泳,切割,DNA,（,210,室）,凝胶成像分析,检测,DNA,断裂,状况（,210,室）,实验技术和方法,实验要求,写好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的,IR,特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等）,实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重量、产率等）,做好每一次测试，并打印结果,实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查,对实验结果作简要讨论,下一次实验提交本次实验报告,遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日,（配位化学、生物无机化学、生物技术）,V.V.,Gerbeleu,V.B.,Arion,J.Burgess,“Template synthesis of,macrocyclic,compounds”,WILEY-VCH,verlag,GmbH,1999.,计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，,生物无机化学,（第二版），中山大学出版社，,2001,。,杨频，高飞编著，,生物无机化学,，科学出版社，,2002,。,F.,奥斯伯，,R.,布伦特，,R.E.,金斯顿 等，,精编分子生物学实验指南,，,1998,年,6,月第,1,版。,参考书,
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