《色谱分离》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,6,色谱分离,主要内容,色谱法概述,柱色谱,纸色谱,薄层色谱,现代色谱分离技术,（气相色谱，,HPLC,，超临界流体色谱）,6.1,色谱法概述,1,、基本概念,色谱法（,Chromatography,）又称层析法、色层法，是一种高效分离方法，能把各种性质相似的物质彼此分离。,色谱法是一种,多级分离,技术，基于被分离物质分子在两相（固定相，流动相）中分配系数的,微小差别,进行分离。当两相作相对移动时，被测物质在两相间进行反复多次分配，微小差别,放大,，使各组分分离。,色谱法已发展为专门学科，经典的液相色谱法，包括柱色谱、纸色谱和薄层色谱。,气相色谱和高效液相色谱已成为仪器分析的重要分支。,色谱法创立者的是俄国植物学家,茨维特,（,Michael Tswett,，,1872-1919,）。,1903,年,3,月,21,日，他在华沙自然科学学会生物学会议上发表了,一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用,研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，即著名的茨维特的色谱实验。,1906,年他又在德国植物学杂志发表文章，首次将分离后色带命名为色谱图，称此方法为色谱法（,Chromatography,）。,茨维特的色谱实验,将一植物色素的石油醚溶液从一根主要填有碳酸钙吸附剂的直立玻璃管上端倒入，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。当时,Tswett,把这种色带叫做,“,色谱,”,（,Chromatography,），在这一方法中把玻璃管叫作,“,色谱柱,”,，碳酸钙叫作,“,固定相,”,，纯净的石油醚叫作,“,流动相,”,。,2,、方法原理,色谱分离过程：当含有不同化合物的试液加样后，它们在同一时刻进入色谱柱上端，同时在固定相和流动相之间分配。分配在流动相的样品组分随流动相流动，而分配在固定相的样品组分则滞留不动。当混合物样品被流动相携带通过色谱柱时，它们在两相之间进行反复多次（通常在,100,次以上）分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的分离效果，造成不同组分在色谱柱的移动速度不同。经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按一定顺序流出色谱柱。,色谱分离原理小结, 不同组分性质上的微小差别是色谱分离的必要条件 不同组分在两相中进行成千上万次的质量交换（分配）是色谱分离的充分条件,3,、固定相和流动相,色谱分离体系有两个相构成，固定的一相称为固定相（,stationary phase,），移动的一相称为流动相（,mobile phase,）。,固定相,，在经典柱色谱中也称为柱填料。通常是一些具有特定的分离性质，具有一定粒度和刚性的颗粒均匀的多孔物质，如吸附剂、离子交换剂、反相填料等。减少固定相粒度，可提高分离柱效，但流动阻力增加，需要加压流动相才能过柱。,流动相,有气体和液体两种。在经典柱色谱中流动相也称为洗脱剂，液相色谱的流动相通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸等）组成。流动相对样品组分要有一定的溶解度；粘度小，易流动；纯度要高。,色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流动相，使分配系数,K,值适当，以实现定量分离的目的。因此，固定相和流动相的选择是色谱分离的关键。,4,、分配系数,在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相，即在两相之间进行分配。分配系数定义为 ：,对于确定的色谱体系，,K,值在低浓度和一定温度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、吸附、离子交换等性质。在色谱分离过程中，,K,值大的溶质，在固定相的停留时间长，移动速度慢。两个化合物之间的,K,值相差越大，越容易分离。,按流动相种类分类,气相色谱,液相色谱,超临界流体色谱,按固定相所处的状态分类,柱色谱,：将固定相颗粒装填在金属或玻璃柱内进行色谱分离。,纸色谱,：利用滤纸作为固定相进行色谱分离。,薄层色谱,：把吸附剂粉末做成薄层作为固定相进行色谱分离。,5,、分类,吸附色谱：,利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。,分配色谱：,利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。,离子交换色谱：,利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离的一种色谱方法。,凝胶色谱（排阻色谱）,：利用惰性多孔物，如凝胶，对不同组分分子的大小而产生不同的滞留作用，以达到分离的色谱方法。,亲和色谱,：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异亲和力，进行选择性分离的一种方法。,按色谱过程的机理分类,色谱法,液相色谱法,气相色谱法,平板色谱法,柱色谱法,薄,层,色,谱,法,纸,色,谱,法,气,液,色,谱,法,气,固,色,谱,法,分,配,色,谱,法,吸,附,色,谱,法,离,子,交,换,色,谱,法,排,阻,色,谱,法,超临界流体色谱法,亲,和,色,谱,法,6.2,柱色谱法,柱色谱（,Column Chromatography,）是最常见的色谱分离形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。,柱色谱主要有,吸附色谱,和,分配色谱,两类。前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收一定量的特殊液体作为固定相。,1,、吸附柱色谱法分离原理,吸附柱色谱法是,利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的,。当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下，吸附和溶解达到平衡。但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。当流速一定时，各组分就依据吸附平衡常数的不同而得到分离。,2,、吸附色谱柱填料,在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）。吸附剂的选择主要根据吸附剂性质和分析要求通过实验来现在。,对吸附剂的一般要求：,具有较大的表面积和足够的吸附能力对不同组分有不同的吸附能力化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化学反应颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验,常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。,吸附剂的选择,在分离极性较强的化合物时，一般选用活性较小的吸附剂。而分离极性较弱的化合物时，就选用活性较大的吸附剂。极性吸附剂选择性地吸附不饱和的、芳香族的和极性分子。非极性吸附剂如活性炭、硅藻土对极性分子无吸附能力,。,3,、吸附色谱洗脱剂,流动相的,洗脱作用实质上是洗脱剂分子与样品组分竞争占据吸附剂表面活性中心的过程,。为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，应根据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的洗脱剂。化合物极性与其结构有关。按结构的特征，各种有机物的极性大小顺序为：烷烃,烯烃,醚类,硝基化合物,酯类,酮类,醛类,胺类,醇类,酚类,酸类常用溶剂的极性大小顺序为：石油醚,环己烷,四氯化碳,苯,乙醚,乙酸乙酯,丙酮,乙醇,水,4,、分配柱色谱分离原理,分配色谱是,利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的,。在分配柱色谱分离时，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或担体中的溶剂，例如，含有一定量水分的硅胶，其所含的水分可作为固定相。当流动相带着试样中的各种组分通过色谱柱时，样品组分就在流动相和固定相之间进行多次反复分配，当不同的组分分配系数有差异时，它们以不同的迁移速度通过色谱柱得以分离。,5,、分配柱色谱的固定相和流动相,常用的载体有硅藻土型、硅胶型、纤维素和高分子聚合物型等；使用的固定相多是一些极性较强的溶剂，如水及各种水溶液，甲醇、甲酰胺等。常用的流动相溶剂有：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷烃和苯等以及它们的混合物。在实际工作中，为了防止色谱过程中流动相把吸附于载体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和，并应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以防止某些被分离组分离解。,6,、,反相分配柱色谱,用有机相作固定相，水相为流动相的色谱分离法称为反相色谱法,。由于反相色谱法的固定相极性小，流动相的极性大，一些非极性的有机物在柱中移动慢，有利于分离。对于无机物分离用的反相萃取色谱法，实际上是一种反相分配色谱法，它具有萃取方法的简便性，又有色谱分离的高效性。实验时，通常是将有机萃取剂溶于挥发性溶剂中配成适当浓度的溶液，把载体浸渍在此溶液中，搅拌或振荡一端时间后，让溶剂挥发制成固定相。,该法的特点：, 可节省大量的有机溶剂； 易改变流动相的实验条件（,pH,、络合剂等），提高分离选择性。,7,、柱色谱实验技术,分配柱色谱法分离速度较慢，处理量小，温度的影响较大，因此能用吸附柱色谱分离的试样总是尽量采用吸附柱色谱法来解决。,1,）装柱常用直径和长度比为,1:10 1:50,玻璃管，下端用玻璃丝塞住或固定一砂芯板。样品量和吸附剂之比，通常为,1:50 1:30,。吸附剂的粒度一般为,80 100,目。使用前应根据需要进行活化处理。 干法装柱：将干燥吸附剂直接装柱，适用于粗颗粒吸附剂的装填。 湿法装柱：将吸附剂倒入合适的溶剂中做成匀浆装柱，适合于细颗粒吸附剂的装填。,2,） 加样溶解样品的溶剂极性要小，样品浓度要适当，但加样体积要尽量小，使样品带尽可能窄。,3,） 洗脱 选择合适的洗脱剂进行洗脱。在洗脱时要控制流速，对于,1cm,直径的玻璃柱，通常是,0.5 2.0 mL/min,。流速太快，分离不好；流速太慢，分离时间太长。洗脱时应注意不让洗脱剂流干，以免影响分离效果。,4,） 组分收集和鉴定,对于有色组分，可以直接看到各个分离后的色带；对于无色物质，可以定体积收集流出液，用薄层色谱或其它检测方法鉴定。,6.3,纸色谱法,以滤纸为载体的色谱法。它具有简单、分离效能较高、所需仪器设备价廉、应用范围广泛等特点，因而在有机化学、分析化学、生物化学等方面得到应用。,1,方法原理,原理：纸色谱法属于分配色谱。在纸色谱分离过程中，由于滤纸纤维素的毛细管现象，使溶剂在纸上渗透展开，这样样品组分在两相中作反复多次分配达到分离。,固定相：滤纸,利用纸上吸着的水分,(,一般的纸吸着约等于自身质量,20,的水分,),流动相：有机溶剂,2.,纸色谱分离展开方式,3.,纸色谱分离装置及操作,层析筒,滤纸,原点,展开剂,取一大小适宜的滤纸条,在滤纸条的下端点上标准和样品,放在色谱筒中展开,取出，标记前沿,凉干,着色，分析,操作步骤,4,比移值,将标准和样品的,R,f,值进行比较，可以对样品进行定性分析,R,f,=,0,1,R,f,=,0,，表明在原点不动,R,f,=,1,，表明随溶剂一起移动,l,标准,样品,B,b,a,A,定性分析,定量分析,截取洗脱 扫描,CCD,摄像,R,f,值相差越大，分离效果越好,5.,应用,甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分离,展开剂：正丁醇：冰醋酸：水,4,：,1,：,2,显色：三茚酮,葡萄糖、麦芽糖和木糖混合糖类的分离,展开剂：正丁醇：冰醋酸：水,4,：,1,：,5,显色：用硝酸银氨溶液喷洒，即出现,Ag,的褐色斑点。,定性：由,R,f,值可判断是哪种糖；葡萄糖的,R,f,为,0.16,，麦芽糖的,R,f,为,0.11,木糖的,R,f,是,0.28,。,6.4,薄层色谱法,薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、,再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。,操作方法,：同纸色谱法,1,、薄层色谱原理,吸附,解吸,再吸附,再解吸多次分配过程,1,、层析缸,2,、薄层板,3,、斑点,4,、原点,5,、,展开剂（流动相）,2,、薄层色谱固定相,（,1,）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围）,（,2,）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围）,（,3,）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离,（,4,）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质,根据制备方法不同，吸附剂又可以分为不同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级。,3,、薄层色谱流动相（展开剂）,正相薄层色谱：含有少许酸或碱的有机溶剂；,反相薄层色谱：无机酸水溶液。,吸附剂和展开剂的一般选择原则是：,非极性组分的分离选用活性强的吸附剂，用非极性展开剂；极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，用极性展开剂。实际工作中要经过多次实验来确定。,4,、薄层色谱法的特点,设备简单，操作方便。,薄层色谱法扩散作用较少，斑点比较密集，检出灵敏度较高。,快速，展开的时间短。比纸上色谱快速。一般纸上色谱需要几小时至几十小时薄层色谱一般只需十几分钟或几十分钟。,广泛地选用各种固定相，比纸上色谱有显著的灵活性。广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。,薄层色谱法适于分析小量样品,(,一般几微克,),，也适于大量样品的分离（几毫克至几十毫克组分）。,使用无机吸附剂，可以采用腐蚀性的显色剂。,应用举例：,硅胶,G(,含煅石膏作粘合剂,),薄层，适当展开剂分离各种有机磷农药。,用硅胶,G,薄层，以丙酮,氯仿,6,：,94),为展开剂，分离和测定食品中黄曲霉,B1,等致癌物质。,5,、薄层色谱应用,广泛，有机物组分检测（有机合成）,6.5,现代色谱分离技术,气相色谱,HPLC,超临界流体色谱,气相（液相）制备色谱,Thanks for Your Attention!,