疫组化技术-理论篇

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,免疫组织化学（理论篇）,(immunohistochemistry),免疫组化的标记物,酶标记,胶体金标记,荧光标记,放射性标记,免疫组化的标记物,酶标记：,应用最广泛,常用标记物：,-,辣根过氧化物酶,(HRP):,染色时同时加底物,H2O2,和供氢体（,DAB,）或,AEC,，生成棕色（,DAB,）或红色（,AEC,）,HRP+DAB,（,H2,）,+H2O2=HRP+2H2O+,氧化型,DAB,呈色,-,碱性磷酸酶,(ALP),：以萘酚,As-Ms,磷酸盐为底物，快蓝,FB/,快红,FR,为呈色剂，生成蓝色,/,红色沉淀。主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞,免疫组化的标记物,胶体金标记：,以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定位、定量研究的方法。胶体金是一种特殊的金属颗粒，呈淡红至深红色，可在光镜下观察。胶体金颗粒大小不同，电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观察。,免疫组化的标记物,荧光标记,:,以荧光素做标记物,与其相对应的抗原或抗体起反应后,形成带有荧光素的免疫复合物上,在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位,对组织中的抗原或抗体进行定位，定量分析。,常用荧光素：,异硫氰酸荧光素（,Fluorescien isocynate FITC,）：黄绿色荧光,德克萨斯（,Texas red TR,）：鲜红色,罗丹明（,Rhodame TRITC,）红色,花青,5,（,Cyanine CY5):,蓝色荧光,免疫组化标记物,放射性标记：,使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显影术对组织中的抗原进行分析。,免疫组化的检测系统,过氧化物酶抗过氧化物酶法（,PAP,）,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（,APAAP,）,卵白素,-,生物素复合物法（,ABC,）,链酶卵白素,-,生物素法（,LSAB,）,抗生物素蛋白链菌素,-,生物素复合物（,SABC,）,酶标聚合物法（,LDP,）如,EnVision,法,增强聚合物一步法（,EPOS,）,催化信号放大法（,CSA,）,石蜡切片标本的处理：,组织离体后尽快固定，切开固定效果好，固定液以,10,福尔马林缓冲液为佳，固定时间在,4h-24h,之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果。,标本的处理时的注意事项,标本的取材厚度以,2mm,为宜，梯度酒精脱水尽量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，,1,3h,为佳，透明过度会导致组织发硬发脆。浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。,标本的处理时的注意事项,切片通常以,3,4um,的厚度为宜,太厚易掉片，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想。裱片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（,48,50,），玻片用,APES,或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。,80,烘烤,1,2h,。,标本的处理时的注意事项,冰冻切片的处理：,冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象。通常以,5um,的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定,2,遍,干燥置入,4,冰箱短期保存，,20,冰箱长期干燥保存。,标本的处理时的注意事项,石蜡切片应用,3,的新鲜,H,2,O,2,进行封闭，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育,10min,。,内源性过氧化物酶的封闭,热抗原修复的缓冲液,有多种不同的修复液，如,pH6.0,柠檬酸缓冲液（最常用）,、尿素、,Tris-HCl、,商品化修复液等。,碱性,pH,修复液常对绝大多数抗体的效果更好。,推荐使用：,EDTA,缓冲液,pH 8.0,或,Tris-EDTA,缓冲液,pH 9.0,是较好的常规修复液,，,可用于大多数热修复有效的抗体（有选择性,pH6.0,缓冲液对抗体,CD7,可能获得结果最佳）。,PAP,笔画圈时应在组织外围,2mm,左右，不宜太靠近组织。,滴加抗体时应从外周环绕，不直接滴加在组织中间，易浪费抗体。,缓冲液中加入适量的乳化剂，可使抗体均匀弥散，节省抗体，如,Triton X-100,等。,减少边缘效应的方法,