限制性酶切与连接

,成都医学院-生化与分子生物实验,实验十,限制性酶切与连接,一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors,主要载体：质粒、噬菌体、病毒,功能：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。,随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体,载体（,Vectors,）,如何构建所需要的载体？,酶切 连接等技术,一、DNA的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来侵袭。,限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为,、,、,型三大类。,第一类（,I,型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割,DNA,链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析,DNA,结构或克隆基因。这类酶如,EcoB,、,EcoK,等。,第三类（,III,型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1.限制性内切酶的类型,第二类（,型）限制性内切酶,就是通常指的限制性内切酶,.,它们能,识别双链的特异顺序,，并在这个顺序内进行切割，,产生特异的片段,；,型酶分子量较小，仅需,Mg,2+,作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；,型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。,限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1.限制性内切酶的类型,粘性末端,：,是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,Eco,RI的识别顺序为：,5 G,|,AATTC 3,3 CTTAA,|,G 5,在双链上交错切割的位置切割后生成,5G AATTC3,3CTTAA G5,各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV 的识别位置是：,5 GAT,|,ATC 3,3 CTA,|,TAG 5,切割后形成,5 GAT ATC 3,3 CTA TAG 5,这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,限制性内切酶,酶分子,识别位点,切割位点,限制作用是否需用 ATP,类,三亚基双功能酶,二分非对称,至少在识别位点外 1000bp,Yes,类,内切酶与甲基化酶分子不在一起,4-6bp,大多数为回文对称结构,在识别位点中或靠近识别位点无特异性,No,类,二亚基双功能酶,5-7 bp 非对称,在识别位点下游 24-26bp,Yes,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E.coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌,(,Heamophilus,influenzae,)Rd,菌株用,d,，即,Hin,d,。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d,，,Hin,d,等。,2.限制性核酸内切酶的命名法,由 pUC18改造而来，大小为 3162bp。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,内切酶：,不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；,注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；,内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常,1u,指在适当条件下，,1,小时内完全酶解,ug,特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以,ug,DNA,对,u,酶短时间为宜。,同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；,内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,注意事项限制性内切酶酶切,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、,SDS,、,EDTA,、,高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。,这种抑制可通过：,增加酶作用单位数（,1020U/ug DNA,）、,增大反应体积以稀释可能的抑制剂,或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,：,反应缓冲液主要由,TrisHCl,、,NaCl,、,Mg2,+,组成，其中,Mg2,+,为内切酶辅基；,TrisHCl,维持反应体系,pH,值在,之间；,NaCl,浓度不同形成种级别的离子强度：,低盐（,10mM,NaCl,),中盐（,50mM,NaCl,）,高盐（,100mM,NaCl,）,不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,连接反应-连接酶（,ligase,）,ligase,又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等,连接酶的催化反应过程需要Mg离子,T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5-磷酸和,3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能,催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核酸的连接。,把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1,1:3,或 3:1 的载体:插入片段摩尔比,连接反应-T4连接酶,反应体系：,载体 DNA 100ng,插入片段DNA 17ng,连接酶 10X 缓冲液 1l,T4 DNA 连接酶(Weiss 单位)0.11u,无核酸酶水加至 10ul,2.孵育反应于：室温下3 小时，或4C 过夜，或15C，418 小时。,实验步骤与试剂（酶切）,质粒,pUC18 DNA,PCR,产物,Hind,内切酶,Hind,10,X buffer,ddH,2,O,实验步骤与试剂,反应体系,质粒,pUC18 DNA 2 l,PCR,产物,2 l,Hind,内切酶,2 l,Hind,10,X buffer,2 l,ddH,2,O,1,2 l,总体系为20 l，混匀,反应步骤,37C,酶切,2h,（各位老师上课只要求,1h,，自己改一下）,65C,灭活,10min,琼脂糖电泳检测,内切酶失活,DNA,不纯，含有,SDS,，,酚，,EDTA,等内切酶抑制因子,条件不适（试剂、温度）,DNA,酶切位点上的碱基被甲基化,DNA,酶切位点上没有甲基化（如,Dpn,I,）,DNA,位点上存在其它修饰,DNA,不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性,将,DNA,过柱纯化，乙醇沉淀,DNA,检查反应系统是否最佳,换用对,DNA,甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒,DNA,转化至,dcm,-,，,dam-,基因型的细菌菌株,换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化,DNA,（如,San3A I,代替,Dpn,I),，,重新将质粒转至,dcm,+dam+,菌株中扩增,将,DNA,底物与,DAN,混匀进行切割验证,换用其它的酶切割,DNA,或过量酶消化进行验证,限制性内切酶酶切,常见问题分析,问题一：,DNA,完全没有被内切酶切割,原因,对,策,内切酶活性下降,内切酶稀释不正确,DNA,不纯，反应条件不佳,内切酶识别的,DNA,位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰,部分,DNA,溶液粘在管壁上,内切酶溶液粘度大，取样不准,酶切后,DNA,粘末端退火,由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性,过度稀释使酶活性降低,反应条件不适,识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用,5-10,倍量过量消化,用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶,同上,同上,反应前离心数秒,将内切酶稀释，增大取样体积,电泳前将样品置,65,保温,5-10,分钟，取出后置冰浴骤冷,使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡,适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏,使用最佳反应体系,加大酶量,5-10,倍,问题二：,DNA,切割不完全,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,内切酶星状活性,其它内切酶污染,底物中含其它,DNA,杂质,检查反应条件：甘油浓度大于,12%,，盐度过低，,Mn2+,的存在及酶：,DNA,值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量,用,DNA,作底物检查酶切结果,电泳检查,DNA,，,换用其它酶切，纯化,DNA,片段,问题三：,DNA,片段数目多于理论值,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA,定量错误（如,RNA,含量较高）,在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用,RNA,酶,A,（无,DNA,酶）,100ug/ml,消化,DNA,样，酚抽提后沉淀溶解，定量,在反应前透析,DNA,样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到,DNA,片段的存在,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,保存温度不合适,以稀释形式保存,贮藏缓冲液不适当,低蛋白浓度,内切酶贮藏在含,50%,甘油的贮藏液中，应在,-20,低温保存,稀释酶液不宜长期存放，应一次使用,使用厂家推荐的贮藏缓冲液,内切酶与,500ug/ml,的,BSA,一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA,上结合有蛋白质,内切酶中含有,DNA,外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后,DNA,片段的带型弥散，不均一,原因,对,策,DNA电泳常见问题分析,含磷酸盐的浓度高,内切酶失活不全或含有,ATP,酶,平末端连接,外切酶污染,连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐,延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收,DNA,加大,T4 DNA,Ligase,用量,减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收,DNA,重新配制连接缓冲液,DNA电泳常见问题分析,问题七,：,酶切后的,DNA,片段连接效率低,原因,对,策,DNA,降解,电泳缓冲液陈旧,所用电泳条件不合适,DNA,上样量过多,DNA,样含盐过高,有蛋白污染,DNA,变性,避免核酸酶污染,电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液,电泳时电压不应超过,20V/cm,，,温度,30,；巨大,DNA,链电泳，温度应,15,；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力,减少凝胶中,DNA,上样量,电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐,电泳前酚抽提去除蛋白,电泳前勿加热，用,20mM,NaCl,缓冲液稀释,DNA,DNA电泳常见问题分析,问题一：,DNA,带模糊,原因,对,策,对于,/,Hin,d III,片段,cos,位点复性,电泳条件不合适,DNA,变性,电泳前于,65,加热,DNA 5,分钟，然后在冰上冷却,5,分钟,电泳电压不超过,20V/cm,；,温度,30,；经常更换电泳缓冲液,以,20mM,NaCl,Buffer,稀释,DNA,，,电泳前勿加热,问题二：,不规则,DNA,带迁移,对,策,原因,DNA电泳常见问题分析,DNA,的上样量不够,DNA,降解,DNA,走出凝胶,对于,EB,染色的,DNA,，,所用光源不合适,增加,DNA,的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低,避免,DNA,的核酸酶污染,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,应用短波长（,254nm,）,的紫外光源,问题三：,带弱或无,DNA,带,对,策,原因,DNA电泳常见问题分析,小,DNA,带走出凝胶,