液相色谱质谱联用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,概 述,LC-MS联用机遇与挑战,LC：适用面广，但定性能力差。,MS：定性能力强，但分析混合物时效果差。,LC-MS 通过LC的分离，使MS可以分析具有大量杂质的混合物中的待,测物，并提高分析的专一性和灵敏度；,LC可以分离同分异构体，弥补了MS的不足。,GC-MS:样品必须气化 不适合极性、热不稳定和大分子化合物。（20%）,LC-MS：不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合,物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广。,LC/MS 联用的主要困难,LC-MS 接口(Interface)类型,API,(atmosphere pressure ionization),ESI(electrospray ionization),APCI(atmospheric chemical ionization),热喷雾(TSP)、等离子体喷雾(PSP)、粒子束(LINC)和动态快原子轰击(FAB)等。,Electrospray ionization(ESI),ESI 将溶液中的离子转变为气相离子,进行MS分析，最软的质谱离子化技术。,Tayler 锥(电泳机制）,24kV,0.1mm,2 cm,1、液体表面带电,2、带电雾滴形成,3、雾滴蒸发,4、气相离子从微小的雾滴产生,LC-MS 中常用电离技术,不同表面张力溶剂的起始电位（,c,0.1mm,d=40mm),ESI 所需电位,为使Taylor发生静电喷雾，在毛细管尖端需施加的起始电位：,溶剂表面张力,Taylor 锥的半角,0,真空介电常数,c,毛细管半径,ESI 实验条件优化,、待测物质,在溶液中的状态（溶液化学）,待测物质在供试品溶液中以离子状态存在，可提高生成气相离子的效率，提高检测灵敏度。,B+RCOOH BH,+,+RCOO,-,HA+NH,3,A,-,+NH,4,+,2、,溶剂的表面张力,纯水，因表面张力高，所需起始电位,U,on,高，易产生放电现象；,常用水甲醇（50:50)溶剂，同时黏度也下降，有利于雾化,3、溶液流速,低流速产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号灵敏度；,高流速范围内，为提高雾化效率，需采用高速同轴气流辅助雾化技术。,4、雾滴的蒸发速率,提高 雾滴蒸发速率的方法：采用挥发性溶剂；提高“干燥气”温度和流速；,使用加热金属毛细管,。,5、气相离子的产生,竞争机制表面活性高（最低溶剂化能）的离子优先转移至雾滴表面，,最 终转变为气相离子，故有较高的实验灵敏度。,1、应采用表面活性低的缓冲剂,2、采用低浓度的挥发性酸、碱及缓冲盐,3、用高纯度的溶剂、试剂,4、样品应作预处理，除去干扰物及盐。,Atmospheric chemical ionization(APCI),样品溶液借助雾化气的作用，喷入高温（如500）蒸发器中，此时溶剂和溶质均为蒸气，由,63,Ni放射源或放电电极产生低能电子使试剂气，如N,2,、O,2,、H,2,O、或溶剂B 等离子化，经复杂的一系列反应使溶质产生正或负离子。,N,2,+e,-,N,2,+,+2e,-,A+BH,+,AH,+,+B(质子转移）,A+B,+,A,+,+B(电荷转移）,Na,+,M+NH,4,+,、M+Ac,-,、M+Cl,-,等。,APCI：适用于小分子极性较低的化合物（醇、醚等）。,ESI：热不稳定或难于气化的极性化合物。,ESI和,APCI,共同点:1、使用高电压元件和雾化气喷雾法产生离子2、通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子3、产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片、非常灵敏的电离技术。,不同点:1、生成离子的方式不同，ESI：液相离子化；,APCI,：气相离子化2、样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子,多电荷离子。,APCI,：非极性，小分子化合物（相对ESI而言）且有一定挥发性，,要产生的是单电荷离子。,基体辅助激光解吸电离(MALDI),1988年，Hilenkamp 和Tanaka 发明，可将热不稳定分子完整地携带进入气相的离子化技术,操作过程：,样品与基质（1:100-50,000)均匀混合，点在样品靶子上，空气干燥，送入离子源。,基质吸收激光能量-基质离子碰撞样品质子化形成分子离子及分子离子的多聚体。,基体作用：,1 在选定波长激光照射下，基体对激光能量有很强的吸收，而分析物一般只有很弱的吸收。,2 基体对分析物起到,溶剂,的作用，减少了分析物分子间的相互作用，减少了分析物簇群形成可能性。,3由于基体浓度远高于分析物，因而确保了激光大部分能量被基质吸收而最小限度地照射分析物。,4 基质常为有机弱酸，作为,质子化试剂,，在分析物离子的形成过程中具有重要作用。,LC-MS中的色谱技术,20世纪80年代商品化，迅速成为应用最广泛的联用技术。,LC-ESIMS灵敏度影响因素：,质量型检测器：响应与待测组分的质量流速成正比，如FID、FPD。,浓度型检测器：检测器响应与流动相中待测成分的浓度成正比。如 UV、TCD。,APCI：质量型检测器-4.6mm i.d.色谱柱；,ESI：表观行为为浓度性检测器-细径色谱柱（mm i.d.或更细）；,进入喷雾器的质量流速；,气化样品离子,离子化效率,可使用柱后分流，不会导致信号损失,LC-ESI MS技术,2-25,m,纯电喷雾,熔融二氧化硅,涂金,1nL 1,L/min,低流速：,LC-ESIMS流速选择,毛细管液相色谱（Cap-LC)和毛细管电泳（CE)与MS在线联用；,样品量有限、灵敏度优先考虑时使用：如肽图谱测定,50-100,m,1 200,L/min,气动辅助,（离子喷雾）,中等流速：,微柱液相色谱与MS在线联用；,适合于既要高灵敏度又需要较大柱容量的工作：如药物代谢定性定量分析（1.1mm),高流速：,气动辅助热辅助,500,200,2mL,/min,雾滴周围的温度尽管有几百度，但当溶剂蒸发时，雾滴会冷却，其温度通常不超过,50，所以有机化合物不会热降解,样品量充足、可鉴定微量杂质：.6mm i.d.,如何将HPLC 方法转化为LC-ESIMS,1、缓冲剂,硫酸盐、磷酸盐及硼酸盐醋酸铵、甲酸铵、三氟乙酸（TFA）、七,氟丁酸（HFBA）、氨水、氢氧化四丁基胺（TBAH)等代替,2、pH 值,通常应保持不变,3、离子对试剂,挥发性的如HFBA、TBAH，但保留时间有波动,4、有机溶剂,基本匹配,5、色谱柱,离子交换柱（高离子强度）、,蔬水相互作用色谱,（盐浓度梯度）,6、柱后修饰,作用：,调节pH值以优化正负离子检测；,添加异丙醇以利于含水溶剂的去溶剂化、稀释缓冲盐；,添加醋酸钠（50,mol/L)使缺乏或只有弱质子化位点的样品阳离子化(a,+,),填充毛细管柱色谱或毛细管电泳，需在柱后添加适当溶剂（补足液流）以达到稳定的喷,雾，以提高质谱响应。,装置,：三通、输液泵,LC-API MS中的质谱技术,ESI 和APCI 均为大气压离子化（API）技术，与经典的离子源不同，需要有从大气压至真空的接口及离子传输等装置。,1、电喷雾和高电压的连接,2、喷雾针的位置和去溶剂方法,带电雾滴进入质谱仪会撞击离子光学元件或质量分析器，产生离子脉冲，在质谱图中出现尖峰信号。,ESI 雾滴的去溶剂可采用热氮气流或加热取样毛细管（防堵塞）等方法。,3、大气压离子源与真空的连接-自由喷射膨胀,M,Mach碟与取样孔距离,D,0,取样孔 内径,p,0,上游（大气压）的压强,p,1,下游（真空）的压强,4、簇离子问题,产生：APIMS 与LC、CE 等联用时，在离子源中有溶剂与水蒸气，由于自由喷射膨胀,而迅速冷却，极性分子将与离子簇合。,防止簇离子的产生-气帘,剥离簇离子上的溶剂分子-碰撞诱导解离,（collision induced dissociation,CID）,在取样孔和取样锥（或取样孔和离子光学元件）之间加一电场，离子在电场作用下被加速。,簇合物与随机运动的背景气碰撞而被“加热”，可导致氢键的断裂。,如果电场较高，不仅剥离溶剂分子，而且也导致样品离子的裂解，这种由样品离子生成,碎片离子的技术称为源内（in source)CID,。,分离大分子物质(如蛋白质)时,碰撞能分配在大量的振动自由度上,不会导致大分子的裂解.,5、仪器调谐和质量坐标的校准,GC/MS PFTBA（全氟三丁胺）,LC/APIMS ：质量范围宽且分布均匀。,PEG 重复单元 CH,2,CH,2,O,生成一系列相差44u 的PEG+Na,+,离子,NaI 用簇离子Na,+,(NaI)n，I,-,(NaI)n 作为 校准物 生成一系列相差150u,的离子.,Thank you!,