《疫原和抗血清制备》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫原和抗血清制备,陈雪丽,陈春婉 冯慧婷 侯纯蓉,兰州大学2010级医学检验二班,案例一,常州狂犬疫苗造假事件,该公司2008年生产的4个批次人用,狂犬疫苗,效价低于,国家标准，可能导致疫苗接种后免疫抗体水平低，无法充分,发挥疫苗应有的,预防保护,作用，属于不合格产品。,什么是疫苗？,抗原？,抗体？,作用？,疫苗,病原微生物,及其代谢产物,预防疾病,用于人工主动免疫的生物制剂,人工减毒、灭活、利用基因工程等,经过特殊处理的抗原,A vaccine is a,biological preparation,that improves immunity to a particular disease.A vaccine typically contains an,agent,that,resembles a disease-causing microorganism,and is often made from,weakened or killed forms of the microbe,its toxins or one of its surface proteins,.The agent stimulates the bodys immune system to recognize the agent,as foreign,destroy it,and remember it,so that the immune system can more easily recognize and destroy any of these microorganisms that it later,encounters,.,疫苗的分类,传统,新型,传统,新型,传统,新型,类毒素,重组抗原疫苗,重组载体疫苗,DNA疫苗,减毒活疫苗,灭活疫苗,亚单位疫苗,合成肽疫苗,基因工程疫苗,免疫原性强的病原微生物，如伤寒、霍乱等，理化方法灭活,人工诱导变异或从自然界中筛选的毒力高度减弱的病原微生物,用0.3%-0.4%甲醛处理，丧失毒性的外毒素,去除有害成分，保留免疫原性成分，脑膜炎球菌荚膜疫苗,将具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列与适当载体或佐剂结合成的疫苗,采用DNA重组技术制备的只含保护性抗原组分的基因工程疫苗,将编码病原体免疫原性的基因插入减毒的病毒或细菌，接种到人体,将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原,疫苗大致可以分为六大类：,灭活疫苗，是被彻底杀死的病原，相当于把反动分子枪毙以后曝尸示众，由于是已经死掉的阶级敌人，,往往导致革命队伍警惕性不很高，常需要反复刺激；,减毒活疫苗，其实就是可以改造好的黑五类后代，经过教育改造，已经减弱或丧失了危害性，进入人体后现身说法介绍反革命分子的长相，,并且可以繁殖供长期围观，效果很好，但也存在突然又反叛的危险，,所以在筛选确认时耗费时间极长；,类毒素疫苗，是处理后的细菌外毒素，相当于,阶级敌人的便便经过消毒后给革命群众作为识别特征,；,亚单位疫苗，是除去其他成分后提取病原体中有效免疫原所得，如多糖类疫苗等，,相当于将谋逆贼子砍头后传首九边以供识别,；,上述种种，均直接来源于病原，真正,像照片,的，其实是,基因重组疫苗和DNA疫苗，它们都是对病原体照相找到编码免疫原的基因这段基因相当于底片，,在基因重组疫苗中，该基因被插入表达系统比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌当中，,酵母菌就是冲片机,，表达出的抗原相当于冲印好的照片，经过纯化制成疫苗；,DNA疫苗则是将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原-,相当于上级只发放底片，得自己冲洗,。,免疫原,疫苗,抗原,抗原,诱导机体产生免疫应答（免疫原性）,与免疫应答产物结合（抗原性）,疫苗,经过特殊处理,诱导机体产生免疫应答,免疫原,诱导机体产生免疫应答,抗原,半抗原,仅具有抗原性,疫苗都是免疫原？,免疫原都是疫苗？,免疫原都是抗原？,抗原都是免疫原？,疫苗,免疫原,抗原,合格疫苗？,安全性,有效性,专一性,可获得性,适合大批量生产,易保存,经济,如何制备？,疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：,1.筛选种毒；,2.扩繁病原；,3.处理纯化；,4.验证批签。,如何制备？,颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）,灭活疫苗,细胞抗原（绵羊红细胞）经,生理盐水等溶液,洗净，配制成一定浓度；,细菌抗原 纯菌增菌后处理,制备菌体(O)抗原置于100水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；,制备H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛处理；,制备细菌毒素抗原，杀菌后用0.5%-1%氯化钙处理。,可溶性抗原,亚单位疫苗,包括：蛋白质、核酸、多糖、脂蛋白等,来源：组织和细胞,步骤：提取和纯化,粗提,组织、细胞破碎，取上清,组织匀浆：必须为新鲜或低温保存,高速组织捣碎机法；,研磨法（脑、胰腺）,2.细胞破碎：,冻融法，缓慢融化，适用于细胞,超声破碎法，间歇进行，适用于细胞,酶法，不易破坏内含物成分，适用于微生物,表面活性剂处理法，多用于细菌提取核酸,纯化（以蛋白为例）,超速离心法,差速离心法 分离大小和密度差异较大的颗粒,差速离心法原理示意图,纯化,密度梯度离心法,将样品放在惰性介质（梯度液）中进行离心沉淀,蔗糖、甘油、氯化铯等,纯化,特点,适用于少数大分子抗原及某些比重较小的抗原,纯化,选择性沉淀法,盐析法,纯度不高，适合初步纯化，常用33%-35%饱和度的硫酸铵,有机溶剂沉淀法 必须在0下进行，常用乙醇和丙酮,聚合物沉淀法 PEG，分子量越大，PEG浓度越低,核酸沉淀剂法 硫酸鱼精蛋白、核酸酶等去除核酸,纯化,层析法,1.凝胶层析法 分子量不同,2.离子交换柱层析法 蛋白质的等电点不同,3.亲和层析法 生物分子结合的特异性和可逆性,纯化-凝胶层析法,纯化-凝胶层析法,纯化-离子交换层析,1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；,2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大,纯化-亲和层析,纯化,电泳法,分子量,电荷数量,纯化,粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；,细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等方法。,必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。,细胞破碎,固液分离,粗分级,细分级,Going Up,纯化抗原的鉴定,含量,双缩脲法、比浊法、酚试剂法、直接紫外吸收法等,分子量,SDS-PAGE,纯度,SDS-PAGE、HPLC,免疫活性,双向免疫扩散、ELISA等,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳-模式图,SDS是一种阴离子表面活性剂,，,能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上,，,使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,人工抗原,人工结合抗原（半抗原）,人工合成抗原,基因工程抗原,人工结合抗原,半抗原（=20）,载体(1),蛋白质 牛血清蛋白,多肽类聚合物 多聚赖氨酸,大分子聚合物 羧甲基纤维素,完全抗原,物理,化学,羧甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,某些功能基团,鉴定,吸收光谱分析法,放射性核素标记法,人工合成抗原,化学方法,化学方法,合成肽疫苗,基因工程抗原,基因工程疫苗,提取、纯化、鉴定,毒性试验（安全性试验）,通常包括杀菌剂的残留，防腐剂的含量，热源含量，有无微生物污染，培养基残留等，例如因为可能有人对鸡蛋过敏，所以所有鸡胚培养的疫苗必须严格监控卵清蛋白残留；而怀疑牛血清中可能有对人体不利的物质，凡添加了牛血清培养细胞的，必须监控牛血清白蛋白残留量；对于灭活疫苗，还要检测其灭活程度，通常是把成品或处理后的原液接种到细胞或实验动物，动物或细胞没有感染迹象才算过关，对于弱毒疫苗，还要用动物做毒力测定，以保证疫苗没有复壮成致病株,。,效力试验（免疫保护实验）,有效性检测,，,最基本的，是用抗血清检查疫苗中确实含有目的抗原，然后做效力测定，给实验动物注射疫苗，检查有无产生促发特异的免疫应答产生特定抗体，或者，比较倒霉的实验动物会被接种致病菌观察疫苗的保护效应,。,我的疑问,抗原到疫苗，到底要怎么处理？,参考：,三枪拍案说疫苗生产,科学松鼠会,蛋白质分离纯化,生物秀论坛,嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制孙建和、严亚贤等,从乙肝疫苗的制备看疫苗纯化技术的发展张国强、赵铠,经验,概念,：,1.看书,2.wikipedia,3.科学松鼠会,方法技术：,1.文献,2.论坛,丁香园,生物秀,小木虫,本次课程结束，谢谢大家,