叶绿体色素的提取分离及其理化性质

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,农业生物学实验教学中心,叶绿体色素的提取分离及其理化性质的观察,一,.,实验目的,因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在生产中有着广泛的应用。,1,.,学习叶绿体色素的提取方法。,2,.,了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主要理化性质。,绿色植物的光合作用是在叶绿体色素参与下进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。,植物色素包括：,脂溶性的叶绿体色素：,存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素、类胡萝卜素等；水溶性的细胞液色素：,存在于液泡中，与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。,二、原理与操作步骤,（二）叶绿体色素的提取原理和方法,各种植物叶绿体中所含的色素有数十种，可分三大类。叶绿素类、类胡萝卜素类和藻色素类（或称藻胆素类）。后一类只存在于藻类。以下只介绍前两类。,(,一,).,实验材料：菠菜叶片,。,叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素,a,和叶绿素,b,，酯类化合物）和黄色素（包括胡萝卜素（烃类）叶黄素（衍生的醇类）两大类。它们与类囊体膜上的,蛋白质相结合,，而成为色素蛋白复合体，,不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。,提取的操作步骤：,乙醇提取液：,（,1,）取菠菜叶片洗净、擦干、剪碎、混匀，称,2g,，放入研钵中。,（,2,）加入少量石英砂及碳酸钙粉，加,1,2,滴管,95%,乙醇，研磨至糊状,；,再加,10,15ml 95%,乙醇，提取,1,3min,，过滤于三角瓶中,；,残渣用,5ml 95%,乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。,提取的操作步骤：,水研磨匀桨：,另取,2g,剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加,2ml,蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水,20ml,，搅均，不过滤。,为做光破坏准备的,乙醇提取液,操作步骤,：,水研磨匀浆,操作步骤,：,因吸附剂（本试验为滤纸）对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。,1.,提取液中各成分分离：,用色层分析的原理加以分离,分配系数,吸附 脱吸附 再吸附 再脱吸附,叶绿体色素的结构决定极性不同，因而在滤纸上的迁移速率不同。,叶绿体色素,叶绿素,类胡萝卜素,叶绿素,a,叶绿素,b,胡萝卜素,叶黄素,叶绿素的化学结构,细菌叶绿素,a,叶绿素,a,叶绿素,b,卟啉,植醇,叶绿醇,烃类,衍生的醇类,吸附剂：滤纸,推动剂：石油醚,:,丙酮,:,苯（,10:2:1,）,步骤：,（,1,）圆形定性滤纸,1,张（直径,11cm,），用细头的吸管在其中,心戳一圆形小孔（直径约,3mm,）。,（,2,）另取一张滤纸条（,5cm1.5cm,），沿纸条长度方向涂色,素，限制在,0.5cm,，风干后，重复涂抹数次。,沿长度方向卷成纸捻。,涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。,涂抹色素的技巧方法：将色素放到一块平板玻璃上，涂,抹纸片，这样涂抹的色带窄，分离效果好。,（,3,）纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，与滤纸平齐（勿凸出）。,（,4,）康维皿放置培养皿内，康维皿中央小室中加满,推动剂。,（,5,）把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸,捻下端浸入推动剂中。盖好培养皿,(,为什么？,),。,（,6,）,推动剂到达滤纸边缘时，取出滤纸，风干。,用铅笔标出各种色素的位置和名称。,（,7,）剪下一部分附到实验报告中。,注意：,1,、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。,细，匀，直，浓。,2,、涂抹的色素要适量，量多易发生拖尾，量少色带看,不清；,3,、纸捻卷紧；,4,、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；,5,、中心孔要小而圆；平齐，勿突出；,6,、分离时一定要盖严，防止推动剂蒸发。,颜色从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。,分别为：？,实验结果,：,标出各种色素名称,（,1,）,.,光对叶绿素的破坏作用,叶绿素（,a,，,b,）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，,特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。,（提取出叶绿素后先做这一步）,用,15N,研究燕麦叶片中色素的合成和分解发现，,72,小时全部更新一遍。,2.,叶绿体色素的理化性质,光对叶绿素破坏的操作步骤：,稀释时不用严格定量？,稀释,2-3,倍，为什么要稀释？,水提取液,暗,光,乙醇提取液,暗 光,注意：色素乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，稀释倍数视提取液的浓度确定，浓度不要过大，否则在短时间之内效果不明显。,光下破坏的时间不要过长，否则看不到效果。阴天可以适当延长，时刻观察。,阴天和晚上上课的同学取滤纸一张，将两种液分别涂抹在滤纸上，带回去，放在光下处理。,水研磨匀浆液,乙醇提取液,置于光下,10,分钟,折叠,剪开,置于暗处,（,2,）、荧光现象,叶绿素的荧光,:,叶绿素酒精溶液在透射光下为翠绿色，在反射光下为棕红色。这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。,叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的,10,左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的,0.l,1,。,当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到红色“余晖”，这是磷光。,如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。,叶绿素的荧光现象,透射光,反射光,如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。,（荧光强度太弱）,取一支,20ml,刻度试管,加入,5ml,浓的,色素乙醇提取液,观察溶液的透射光,与反射光有何变化？,（,3,）、皂化作用,C32H30ONMg,COOCH,3,COOC20H39,+2KOH,C32H30ON4Mg,COOK,COOK,+CH3OH+C20H39OH,叶绿醇,甲醇,叶绿素是一种二羧酸,-,叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，可与碱起皂化反应，生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,步骤：,1,、加入,1.5ml 20%KOH-,甲醇溶液，充分摇匀；,2,、加入,5ml,苯，摇匀 ；,3,、加入适量蒸馏水，沿管壁。,注意,：如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈摇动，对试管加温，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。原因，可能是温度较低引起的。,（,4),、吸收光谱的观察,叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定,太阳光不是单一的光，当一束阳光通过三棱镜后，就象雨后的彩虹那样，可分为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色，形成连续的可见光谱。如果在阳光与三棱镜之间插入一支盛有叶绿素的试管，那么，在光谱中的红光与蓝紫光的部位就会出现很深的黑带，表明这些光线已被叶绿素强烈吸收；而绿光部位没有黑带，也就是未被吸收。因此，叶绿素呈现绿色。胡萝卜素与叶黄素主要吸收蓝紫光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。,(5),、,H,+,和,Cu,2+,对叶绿素分子中,Mg,2+,的取代作用,H,+,Cu,2+,叶绿素中的可,Mg,2+,被,H,+,所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。,1,小试管,步骤：,加乙醇色素提取液,2ml,稀释,3,倍,取出,1/3,放到,2,（,CK1,）,加,5,盐酸,1,滴,摇均匀,取出,1/2,放到,3,（,CK2,）,加入醋酸铜粉末少许,不断摇动，文火加热（严禁放到火上烧）,3,支试管进行比较，记录颜色变化,加热时试管不能靠近火焰，温度过高将破坏叶绿素。,加热时试管不能靠近火焰，温度过高将破坏叶绿素。,三、结果记录：填写记载表,洗刷干净，器皿摆放整齐,研钵壁上易吸附色素，用什么洗刷？,节约使用试剂,