分子生物学实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学实验,腺嘌呤脱氨酶基因工程菌的构建,日,8AM5PM,TA,质粒（含,ade,基因）,pMal-c2x,质粒,双酶切,电泳,双酶切产物片段的回收,目的基因与载体片段连接（过夜）,实验内容：酶切和连接反应,E.,coli,TB1,菌株,37,过夜培养，第二天做感受态细胞用。,一8AM5PM,实验内容：,感受态细胞的制备和转化,原理,1.,细菌在,0,C CaCl,2,低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源,DNA,的状态。,2.,质粒,DNA,粘附在细菌细胞表面，经过,42,C,短时间的热击处理，促进吸收,DNA,。,然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。,二,1PM5PM,实验内容：,挑单斑，摇菌,收平板,挑取单斑（白斑）,摇菌：,3050mL,用于提取质粒,三,8AM5PM,质粒提取,实验内容：,转化克隆的筛选和鉴定,电泳观察,PCR,筛选,双酶切鉴定,双酶切反应,TA,质粒和,pMal-c2x,质粒分别以,EcoR,（,GAATTC,）和,Sal,（,GTCGAC,）,进行双酶切，,20L,质粒酶切反应体系如下：,TA,质粒,pMal-c2x,质粒,7L 9L,10EcoR,缓冲液,2L,2L,BSA 0.2L,0.2L,水,0.8L,0.8L,EcoR,0.5L,0.5L,Sal 0.5L,0.5L,无菌水,9L 7L,37,酶切反应,2,小时。,注意事项：,内切酶要放到最后加入,电泳及凝胶回收,琼脂糖凝胶电泳检验酶切产物，,使用,UNIQ-10,柱式凝胶回收试剂盒,分别对目的基因片段（,TA,质粒酶切反应中得到的,1.7Kb,片段）和载体片段（,pMal-c2x,质粒酶切反应中得到,6.6Kb,片段）进行凝胶回收。,1.,Excise the DNA fragment,from the,agarose,gel with a clean,sharp scalpel.Weigh the gel slice and transfer to a 1.5-ml,microfuge,tube.,2.Add 400,m,l of Binding Buffer,to 1 volume of gel(100 mg=100,m,l).Incubate at,50-60,for 10 minutes and shake occasionally until,agarose,is completely dissolved.,3 Place a spin column in a 2-ml collection tube.Transfer the above mixture solution to the spin column.,Let it stand for 2 minutes,.Spin at 8,000 rpm for 1 minute and discard the flow-through in the tube.,4.Add 500,m,l of Wash Solution,and spin at 8,000 rpm for 1 minute.Discard the solution in the tube.,5.Repeat step 4.Spin at 10,000 rpm for additional 30 seconds to remove residual Wash buffer.,6.Place the column in a new clean 1.5-ml,microfuge,tube.Add 30-40,m,l of Elution Buffer to the center part of the membrane of the column and incubate at 37 or 50,for 2 minutes.Spin at 10,000 rpm for 1 minute to elute DNA.Store the DNA elution in 20,freezer.,Binding Buffer,是否有沉淀,可,适当延长时间,Wash Solution,中,加入乙醇的比例,洗脱时间延长！,注意任一步骤的残液不要倒掉,以防丢失目的,DNA,连接反应,在灭菌的,0.5mL,离心管中进行。,10L,体积反应体系中：,2,快速连接缓冲液,5L,目的基因的双酶切产物,XL,pMal-c2x,质粒双酶切产物,XL,T4-DNA,连接酶,0.3L,轻轻混匀，室温下放置过夜。,注意事项：,目的基因和,c2x,质粒双酶切产物的加入比例应根据电泳结果而定，使加入的,2,片段的浓度比为,1,：,1,剩下的酶切片段不要丢掉，留做转化时做对照,感受态菌的制备,（,1,）,E.,coli,TB1,菌株,37,过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液,1mL,加入到,50,mL,LB,培养基中，,37,，,230 r/min,振荡培养,3 h,，至,A600,约为,0.4,左右。,（,2,）无菌条件下，将,50mL,菌液转移至,离心管,中，冰上放置,10 min,，,使培养物冷却至,0,。,（,3,）在预冷,4,的离心机上以,4000 r/min,离心,10min,，,弃去上清，加入,5mL,预冷的,0.1mol/LCaCl2,溶液重悬沉淀，冰浴上放置,10 min,。,（,4,）以,4000r/min,在,4,离心,10min,，,弃去上清，每,50mL,初始培养物用,2mL,预冷的含有,10%20%,甘油的,0.1mol/LCaCl2,溶液重悬细胞沉淀，,100L/,管分装，于,-70,条件下，可保存半年。,注意事项：,1.,细胞一旦离开培养基，实验操作要轻柔,2.,整个实验过程中注意将细胞置于冰上,不能摇过了！选用处于对数生长期的细胞,预先冷却,pMal-ade,重组质粒的转化,（,1,）向分装有,100LE.,coli,TB1,菌株感受态细胞的,EP,管中加入,2 L,的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置,30 min,。,（,2,）,将该,EP,管放入预加温至,42,的水浴中，放置,90s,，,快速转移到冰浴中，使细胞冷却,12 min,。,（,3,）向,EP,管加入,900 L LB,培养基，转移至,37,摇床上，,150r/min,，,温育,45 min,以复苏菌株。,（,4,）将,200L,上述培养物加到含,100g/mL,氨卞青霉素的,LB,平板上（平板表面涂有,20mg/mL,的,X-gal 40L,和,20mg/mL,的,IPTG 40L,），,以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。,（,5,）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，,37,过夜培养；,水浴温度要准确，热击时不要,摇动,EP,管,UNIQ-10,柱式质粒小量抽提,1,将过夜培养的,1,2ml,细菌,12,000rpm,离心,15,秒，彻底去除上清。,2,加入,100,l Solution I,，,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。,3,加入,200,l Solution II,，,立即温和混匀（倾斜,45,度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置,2,分钟。,4,加入,350,l Solution III,，,立即上下颠倒,5,10,次，使之充分中和，室温放置,2,分钟。,5,12,000rpm,，,离心,5,分钟。,6,将步骤,5,中上清转移到套放于,2.0-ml,收集管内的,UNIQ-10,柱中，,8,000rpm,室温离心,15,秒。,7,弃收集管中的废液，将,UNIQ-10,柱放入同一支收集管中，吸取,500,l Wash Solution,到,UNIQ-10,柱，,10,000rpm,室温离心,30,秒。,8,重复步骤,7,。,9,弃收集管中的废液，将,UNIQ-10,柱放入同一支收集管中，,10,000rpm,室温离心,30,秒以彻底去除,Wash Solution,。,10,将,UNIQ-10,柱放入新的洁净,1.5-ml,离心管中，加,50,l Elution Buffer,，,室温放置,2,分钟后，,10,000rpm,室温离心,1,分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒,DNA,。,注意：对于低拷贝数的质粒，请用,2,5ml,细胞，同时按比例相应提高,Solution I,，,II,和,III,的用量。在执行步骤,5,后，将上清分批加入到,UNIQ-10,柱中，重复步骤,6,，直至处理完所有样品。,注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组,DNA,污染,。,注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组,DNA,和蛋白质污染。,注意：（,1,）如果要提高质粒的浓度，可以用,30,l Elution Buffer,，,37,或,50,下放置,2,分钟，,10,000rpm,室温离心,1,分钟。（,2,）,5580,洗脱可提高回收率,1020,个百分点。,PCR,筛选,1,、调整模板（,pMal-ade,重组质粒,）浓度至,5,ng,/L,。,2,、,按下列体系配制反应混合液，混匀，,Template DNA 1.0 L,（,20,ng,）,10 buffer 2.0 L,MgCl2,（,25mmol/L,）,1.5 L,Primer 1(10mol/L)0.5 L,Primer 2(10mol/L)0.5 L,dNTPs,（,2mmol/L,）,2.0 L,Taq,酶（,5U/L,）,0.5L,加,ddH,2,O,至,20L,外源基因的特异引物：引物,1,（,5-CCG GAA TTC TTG AAT AAA GAA GCG CTA GTC3,）,和引物,2,（,5-CGG GGA TCC GTC GAC TTA TTG CAG TGA TAT GTG TTG3,）。,3,PCR,反应循环条件设置,94,变性反应,1min,；,55,退火反应,45s,；,72,延伸反应,1min,。,进行,25,个循环后，最后一个循环,72,延长至,10min,。,迅速冷却,4,。,4,、检测,加,2L,溴酚蓝和,10L,反应产物，混匀，取,15L,反应产物点样电泳。,5,、成像分析,在,1%,的琼脂糖凝胶上点样电泳,0.51h,，,电泳结束后,EB,染色,15,20min,，,凝胶成像分析结果。,