PCR法获取目的基因

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,法获取目的基因,农学,112,班,马晴晴 孙婷婷,张 娜 金漪倩,胡 斐 徐振鹏,PCR,技术的定义及其发展历史,PCR,技术的原理,PCR,的反应体系和条件,PCR,法获取目的基因,PCR,技术的未来展望,PCR技术 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),PCR,技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增,DNA,或,RNA,的方法。,在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。,一、,PCR,技术的创建,1.Khorana,等,1971,年提出在体外经,DNA,变性、,与适当引物杂交、再用,DNA,聚合酶延伸,克隆,DNA,的设想。,2.1983,年,Mullis,发明了,PCR,技术,使,Khorana,的设想得到实现。,3.1988,年,Saiki,等将耐热,DNA,聚合酶（,Taq,）引入了,PCR,技术。,4.1988,年，第一台,PCR,仪问世。,5.1989,年美国,Science,杂志比喻,1989,年为,PCR,爆炸年,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,二、,PCR,技术的原理,1.PCR,技术,在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板,DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性,DNA,聚合酶,一对合成,DNA,的引物,通过,高温变性,、,低温退火,和中,温延伸,三个阶段的循环合成,DNA,，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过,30,次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。,PCR,原理,（,1,）类似于,DNA,的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在,（,3,）重复,“,变性,-,退火,-,延伸,”,的循环，可获得大量的新,DNA,链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量,DNA,产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。,（,2,）,PCR,过程：由变性,复性（退火）,-,延伸三个基本反应步骤构成,变性：,94,左右，使双链,DNA,模板解离成为单链；,复性：,55,左右，引物与模板,DNA,单链互补配对结合；,延伸：,72,左右，,“,模板,-,引物结合物,”,在,DNA,聚合酶作用下，以,dNTP,为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的,DNA,链,2.PCR,技术的特点,1,）速度快，灵敏度高：经过,30,轮循环，理论上目的产物的 扩增量达,2,30,个拷贝（,10,9,拷贝）。,2,）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定,PCR,反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。,3,）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出,1g,基因组,DNA,中仅含数个拷贝的模板序列。,三、,PCR,的反应体系和基本步骤,H,2,O,35,L,10PCR反应缓冲液,5,L,25mmol/L MgCl,2,4,L,4种dNTP,4,L,上游引物（引物）,0.5,L,下游引物（引物）,0.5,L,模板DNA,(约1ng),0.5,L,Taq,酶,0.5,L,1.,反应体系组成成分,（总体积：,50,L,）,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,Mg,2+,预变性,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,Mg,2+,TaqDNA,聚合酶,94 5min,2.,基本程序,PCR排管,Taq,酶,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,Mg,2+,循环仪,94,55,72,72 5,7 min,循环,25,35,次,扩增出的目标基因,琼脂糖凝胶电泳,转移点样,进行电泳,扩增出的目的基因,3.PCR,反应条件,循环参数,（,1,）预变性：,94 5 min,（,2,）变性：,94 20 s-45 s,使双链,DNA,解链为单链,（,3,）退火：温度由引物的解链温度,Tm,决定，时间,45 s,左右。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度,可增加反应的灵敏性。,（,4,）延伸：一般为,72,，时间由扩增片段长度决定。,（,5,）循环次数：主要取决于模板,DNA,的浓度，一般为,25-35,次,次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。,（,6,）延伸补齐：,72 5 min10 min,PCR,技术的注意事项,1.,合理分隔实验室,将样品的处理、配制,PCR,反应液、,PCR,循环扩增及,PCR,产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及,PCR,产物的鉴定应与其他步骤严格分开。,2.,吸样枪,由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。,3.,试剂分装,所有的,PCR,试剂都应小量分装，,-20,保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，,PCR,试剂和,PCR,反应液应与样品及,PCR,产物分开保存。,4.,防止操作人员污染,一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。,四、,PCR,法获取目的基因,由,Taq DNA,聚合酶扩增的,PCR,产物中，其,3,末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是,A,，因为,Taq DNA,聚合酶对,dATP,具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用,T,载体克隆目的基因。,1.T,载体克隆,PCR,获取的目的基因,具有,3-5,外切酶活性的,DNA,聚合酶（如,pfu,聚合酶），其扩增的,PCR,产物是平末端,要对这种平末端的,PCR,产物进行克隆,应首先对,PCR,产物的,3,末端进行加,A,的工作。工作程序如下,方案一,胶回收平末端,PCR,产物，进入,5l 10Tag DNA Polymerase Buffer,、,4,种,dNTP,或,dATP,（终浓度为,200nM,）、,2.5U Tag DNA Polymerase,，加水至终反应体积为,50l,，,72,保温,10min,，纯化,PCR,片段后进行,TA,克隆,方案二,PCR,反应（,50l,反应体积）结束以后，加入,1l 20mM dATP,和,2.5U,的,Tag,酶，,72,保温,10min,，然后进行直接进行,TA,克隆,2.,设计酶切位点克隆,PCR,获取的目的基因,3,5,限制性内切酶的识别序列,目的基因的,PCR,片段,3,5,限制性内切酶的识别序列,经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体,经限制酶切割得到粘性末端,体外连接,获得目的基因的克隆,1,、不对称,PCR,2,、反向,PCR(reverse PCR),3,、多重,PCR,（复合,PCR,）,4,、,LP-PCR,（,Labelled primers),5,、锚定,PCR,（,anchored PCR,A-PCR,）,6,、,PCR,固相分析法,7,、原位,PCR,8,、反转录,PCR,（,RT-PCR),9,、,荧光定量,PCR,（,real-time PCR),五、,PCR,的类型,荧光定位,PCR,技术（,FQ-PCR,）,FQ-PCR,的工作原理是利用,Taq,酶的,5 3,外切酶活性，在,PCR,反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的,DNA,模板发生特异性杂交，探针的,5,端标以荧光报告基团，靠近,3,端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。,当,PCR,反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和,PCR,产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测,出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的,PCR,定量原理创造了条件。,PCR,技术的应用举例：,研究：基因克隆；,DNA,测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合,DNA,序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生,DNA,标志；遗传图谱的构建,(,检测,DNA,、多态性或精子绘图,),；物理图谱的构建；测序，表达图谱,法医：犯罪现场标本分析，,DNA,检测比对，,DNA,安保标记。,医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。,组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。,古生物学：考古与博物馆标本分析。,动物学：动物传染病的诊断等。,植物学：检测植物病原等。,PCR技术的未来展望,到,2030,年，由于基因技术的空前发展，一个人的全部基因组序列可能只需要,1000,美元就能得到。,基因定制，基因医疗，基因药物都不会再是设想，而将逐渐成为现实，而这一切，都建立于,PCR,技术所树立起来的基础之上。随着技术发展，个人基因信息也许会成为新的重要隐私。,谢谢！,请老师和同学们批评指正。,