HIV检测及临床意义参考ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HIV,检测及临床意义,中国医科大学附属一院,艾滋病确认实验室,尚 红,1,HIV,的发现,Montagnie (LAS) 1983.,Science,220: 868-871,Gallo (HTLV) 1983.,Science,220: 865-86,Levy (ARV) 1984.,Science,225: 840-842,1986,国际病毒分类委员会,：,HIV,HIV-2,1986,西非,2,中国每年新发现的,HIV/AIDS,病例数（,19852002,）,3,HIV,感染可通过两种途径检测,直接检测病毒或其组成部分,检测人体,HIV,免疫反应,HIV,特异性抗体,从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为,1-3,个月，有一小部分,HIV,感染者出现延迟反应,4,HIV,感染后抗原和抗体的变化及其与疾病关系,HIV,感染人体后出现一过性病毒血症，,6-8,周后血清抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的,5-8,年无症状带毒期里,HIV,抗体一直存在，但病毒难查到。进入,AIDS,期后血浆中病毒再次出现。,故诊断,HIV,感染多数时间用抗体检测诊断，极早期（窗口期）用抗原检测。,5,HIV,抗体诊断,目前临床上实际应用的是测定特异性,HIV,抗体，包括,初筛,和,确认,实验。,6,一、检测试剂,筛查试剂必须是,HIV-1/2,混合型、经国家药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。,目前常用的筛查试剂有,酶联免疫,、,颗粒凝集,和其它,快速诊断试剂,。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。,自采自供血的单位必须进行,HIV,抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查。,7,2,、,确认试剂必须,经国家药品监督管理局注册批准。确认试剂包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验试剂。目前以免疫印迹试剂最为常用。,8,ELISA,方法：,目前,最常用的初筛实验,，自,1985,年首次检测,HIV-1,抗体的试剂盒供市以来，已从第一代的全病毒抗原间接法发展到第四代的以重组的多肽抗原及抗,P24,抗体包被的双夹心法，使窗口期缩短了,2-3,周。,9,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,solid,phase,specific,detection of,conjugate,第一代,病毒裂解液,HIV-1,IgG,抗体,HIV-1,-,IgG,抗体,第二代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1 / -2,IgG,抗体,HIV-1 / -2,IgG,抗体,第三代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1 / -2 / -O,IgM / IgG,抗体,HIV-1 / -2 / -O,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1 / -2 / -O,第四代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1 / -2 / -O,anti-p24 Ab,IgM / IgG,抗体,HIV-1 / -2 / -O,p24,抗原,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1 / -2 / -O,anti-p24,抗体,10,Closing the window,4,th,gen,3,rd,gen,=,=,1,st,-2,nd,gen,HIV antigen,IgM ab,IgG ab,Detection limit,1000,）提示感染发生的可能性非常大。,使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析与判断。,23,2,、窗口期辅助诊断,在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒,RNA,测定具有特殊的意义。,目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的,RNA,检测以降低窗口期传播的残余危险度。,24,3,、病程监控,由于,HIV,感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。,通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与,AIDS,发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与,HIV,感染有关。,25,4,、指导治疗方案及疗效测定,并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如,35000-50000,拷贝,/,毫升）才具有良好的效果。,只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低,50%,才被认为临床有效。,通过监测病毒滴度反映疗效,26,5,、预测疾病进程,HIV,疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒,RNA,水平可大致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量与,6,年发病率的关系为：,30000,时则为,80%,。,27,定性检测,HIV,核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于,HIV,感染的辅助诊断。通常使用,PCR,或,RT-PCR,技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见的毒株，也可使用复合引物。,28,定量检测,定量检测常用于监测,HIV,感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的,HIV RNA,定量测定方法有逆转录,PCR,实验（,RT-PCR,）、核酸序列扩增实验（,NASBA,）、分支,DNA,杂交实验（,bDNA,）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为,20-50,拷贝,/,毫升,按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样品量。,测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除,HIV,感染。,应附上仪器打印的数据。,29,Roche,Bayer (,前,Chiron),Organon,技术,RT-PCR,bDNA,Nuclisens HIV-1 QT,结果,比较,约,2xbDNA 2.0,2.0,版结果约为,RT-PCR,的,50%,，,3.0,版结果与,Roche,基本相同,与,Roche,基本相同,优点,通过了,FDA,认证,假阳性结果较,bDNA,少,1.5,版对,A-G,亚型有较好的反应性,操作时间较少,对,A-G,亚型有较好的反应性,通过了,FDA,认证,可使用多种组织，如生殖道分泌液,对,A-G,亚型有较好的反应性,检测范围大,缺点,操作容易污染,测定范围较小（相对于,NASBA,）,少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液,早期版本对部分亚型反应性较差，,1.0,版对非,B,亚型的样品反应性普遍较差，（,5,）版通过改进,对,O,亚型检测能力较差,对低值样品检测的特异性较差。,无内部质量控制，尤其在,3.0,版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。,不同版本间差异较大，,2.0,版约为,RT-PCR50%,，,3.0,版结果与,Roche,基本相同表明两个版本间差异可能达到,50%,。,对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。,对抗凝剂敏感，只能使用,EDTA,。,早期版本（,NASBA,）对部分亚型（,G,亚型）反应性差。,操作复杂，样品提取,(,不使用自动提取仪时,),和测定反应时需要进行大量的手工操作。,不适合一次大量检测，,ECL,读数仪每次只能进行,12,个样品的检测。,实验内、外误差相对较大。,检测,范围,标准版,(Amplicor 1.0,及,1.5)400 - 750,000 c/mL,超敏版,(Ultra-Direct 1.0 and 1.5):50-75,000 c/mL,bDNA 3.0,版,:,100-500,000 c/mL,Nuclisens HIV-1 QT: 40-10,000,000 c/mL (,取决于样品量,),各种,HIV,定量检测方法的比较,30,关于不同,HIV,定量检测方法的选择,目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世,不同定量方法结果之间还无法直接比较,同一病人治疗前后建议用同一方法进行,HIV,定量检测,31,艾滋病免疫指标的检测,32,随着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙光。,艾滋病临床治疗中各种,免疫指标,(CD4+,、,CD8+T,细胞 等,),对于确定感染状态、预测发病、评价药物疗效及新药开发具有重要的作用。,33,CD4 T,淋巴细胞,：,（流式细胞术）,CD4 T,细胞是,HIV,的主要靶细胞,感染后随着病程进展，,CD4 T,细胞不断下降, 500/,mm,3,有临床诊断意义, 200/,mm,3,AIDS CDC,病程进展，,AIDS,诊断和疗效观察的指标,34,HIV,感染几周内，出现类流感症状，也称为血清阳转期，,CD4,细胞的数量降低。随之出现的免疫应答可以控制急性症状，恢复,CD4,细胞的数量，但并不能清除病毒。随着,CD4,细胞不断下降，当降至,500/ul,左右时，开始出现机会性感染或其它疾病，进入症状期。当,CD4,低于,200/ul,时，即进入艾滋病期。,35,CD4+T,淋巴细胞小于,350/ul,（结合病毒载量，确定治疗时机）,有,效,治疗,8,周后,CD4+T,淋巴细胞数量增加,50/ul,HAART,无效,CD4+T,细胞数量下降,CD4+T,淋巴细胞介导的免疫功能逐渐丧失,CTL,丧失必要的体内环境，功能下降,HIV,感染,36,病毒变异和耐药性的测定,随着,HAART,治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株正在不断出现，甚至对一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药。,因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的测试方法，包括,基因型,HIV,耐药测试,和,表型,HIV,耐药测试,。,37,表型,HIV,耐药性测试方法,能直接测出,HIV-1,对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导,HIV-1,感染者有效地用药。,目前市面上供应试剂盒已有,2,种，即,AV,（,Vicro Antivirogram,）,和,PS,（,Virologic PhenoSense,）,，两者方法均应用从生长于载体中的,HIV-1,而获得的重组病毒和病人标本中蛋白酶与逆转录酶序列，分析与野病毒之间,IC50,值相差倍数，一般达,5,10,倍以上为阳性。,这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。,38,基因型,HIV,耐药性测试方法,当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药物的治疗效果。,检查从病人血液标本中分离到的,HIV,基因物质，应用核酸序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况，,优点简单快速，费用低。,缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐药的程度。,39,