《猪血清白蛋白的分》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血清白蛋白的,分离、纯化与鉴定,血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的,60,。,它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。,此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛 。,实验目的,掌握血液样品的正确处理和,制备,方法,掌握血清白蛋白粗,分离,的一般方法,掌握离子交换法分离,纯化,蛋白质,掌握蛋白质,纯度,检测的方法,掌握,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质,分子量,的原理和方法,学会考马斯亮蓝法测定蛋白质,含量,原理与操作,血清的制备,白蛋白的分离,白蛋白的纯化,蛋白质含量的,测定,白蛋白纯度的检测,白蛋白的相对分子质量的测定,留样：,2,，,3,留样：,4,留样：,1,一、,血清白蛋白的分离,1,采血,2,血清分离,3,盐析法分离血清白蛋白,4,除盐,收集血清：,取,2 mL,血液，,4 ,，,3,000 rpm,离心,15 min,，用移液枪吸取,上清（血清）,1 mL,至,10 mL,离心管；,留,0.1mL,（样,1,）,至,1.5 mL,离心管，用于测定蛋白质含量和电泳,.,盐析：,中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。,中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。,分级盐析,实现蛋白质的分离纯化。,在血清中加入硫酸铵，当饱和度为,50%,时，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达,55%,，白蛋白析出,。,量筒量取,9 ml,底液（,50 %,的饱和硫酸铵溶液），,用移液管逐滴加入，不断摇晃。,4 ,静置,2 h,；,4 ,，,13,000 rpm,离心,20 min,，收集上清，,留,0.5 ml,（样,2,）,至,1.5 ml,离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；,用,5%,的柠檬酸缓冲液调节,pH,至,4.5,，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（,pH4.5,）的体积（,0.11V,）；,逐滴加入饱和硫酸铵（,pH4.5,），振荡，,4 ,静置,2 h,；,4 ,，,3,000 rpm,离心,20 min,，弃上清，沉淀用,0.5 mL pH7.4,的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入,pH 7.4,的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无,NH4,存在；留,0.1 ml,（样,3,）,至,1.5 ml,离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；,NH4,的检测：奈氏试剂,奈氏反应,奈氏试剂是络盐,K,2,HgI,4,加,KOH,的溶液，在无机化学定性分析中，用其,检验氨或铵盐,砖红色的溶液或沉淀,二、血清白蛋白的纯化,离子交换,柱,层析,：,离子交换柱,的,安装,平衡,加样,洗脱,样品收集,在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。,蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度或,pH,来完成,，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。,本实验采用的,DEAE,纤维素离子交换剂,.,层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐浓度和（或）,pH,的方式洗脱，后一种方式又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改变（梯度洗脱），另一种是,渐进式的连续改变（连续洗脱）,。,除硫酸铵后的白蛋白溶液在,0.02mol/L,pH7.4,醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（,DEAE,）一纤维素层析柱上，在此,pH,时，,DEAE -,纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、,及,球蛋白（血清白蛋白等电点为,4 . 9,，绝大多数。,及,球蛋白等电点均小于,6,）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的,球蛋白、,球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。,DEAE-,纤维素离子交换层析：,装柱：将层析柱垂直固定。将,DEAE-,纤维素装入柱内，至,8-10cm,高度，平衡过夜；,洗脱液流速调节为,1mL/min,；,上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；,洗脱：采用连续梯度洗脱，用,0.02,1.0mol,L,醋酸醋酸铵缓冲液（,pH7.4,）进行洗脱，收集；,记录出现峰值的管号,(,样品,4,),洗脱速度慢，可直接换,B,液（,1.0mol,L,醋酸醋酸铵缓冲液）,五、,血清白蛋白的相对分子质量,测定,-SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,SDS,的作用：,1.,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；,2.,能与变性的蛋白质按比例结合，形成,SDS-,蛋白质复合物。,SDS-,蛋白质复合物的特点：,1.,由于结合大量的,SDS,，使蛋白质丧失了原有的电荷状态；,2.,复合物都是椭圆棒状。,因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于,分子量,大小。,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，,lgMW,为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的,lgMW,，再换算成蛋白质分子量,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标为,lgMW,为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的,lgMW,，再换算成蛋白质分子量,在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：,logMW=K-Bx,（,MW,为分子量，,X,为迁移率，,k,、,B,均为常数）,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,计算猪血白蛋白的分子量 ：,logMW=K-Bx,标准蛋白质,分子量,兔磷酸化酶,B,97 400,牛血清白蛋白,66 200,兔肌动蛋白,43 000,牛碳酸酐酶,31 000,胰蛋白酶抑制剂,20 100,鸡蛋清溶菌酶,14 400,胶的制备,编号,溶液名称,12%,分离胶,4%,浓缩胶,1,30% Acr 0.8% Bis,2.0ml,0.33ml,2,pH 8.9 Tris -HCI,1.25ml,-,3,pH 6.7 Tris- HCI,-,0.63ml,4,10%SDS,100ul,25ul,5,TEMED,2.5ul,2.5ul,6,10%AP,50ul,12.5ul,7,H,2,O,1.65ml,1.5ml,总体积,约,5 mL,约,2.5 mL,样品的处理,向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴,3 min,，取出冷至室温。,上样顺序：标准蛋白；样品,1,；样品,2,；样品,3,；,柱层析高峰管号的蛋白质样品,4,；,加样量：,20L.,电泳：点样端负极，恒压：开始,80V,，待样品进入分离胶后,120V,。,电极缓冲液：,pH 8.3 Tris Gly,染色：脱色考马斯亮兰,R-250,，过夜。,脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇,=75,：,875,：,50,）脱色,1-3h,。,四、考马斯亮兰法测定蛋白质含量,考马斯亮蓝,G250,的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在,465nm,。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为,595nm,，考马斯亮蓝,G250 -,蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度,.,在一定范围内，考马斯亮蓝,G250-,蛋白质复合物呈色后，在,595nm,下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定,操作,（,mL,）,编号,0,1,2,3,4,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,标准蛋白,0,0.4,0.8,1.2,1.6,2,水,2,1.6,1.2,0.8,0.4,0,考马斯亮蓝,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,标准蛋白液：,50g/ mL,；样,1,、,2,、,3,稀释,100,倍,样,1,稀释,600,倍（,10,l6ml,）；样,2,、,3,稀释,200,倍（,10,l2ml,）；各峰,稀释,5-10,倍（,10,l6ml,）,按上表加好试剂后,摇匀,，以,0,管为对照，于,595nm,处测定光吸收值，以,管做出标准曲线；各样品的光吸收值，取平均值，从标准曲线中查出蛋白质的,g,数。,三、,血清白蛋白纯度的检测,-,聚丙烯酰胺凝胶,(PAGE),电泳法,A,、胶的制备,编号,溶液名称,12%,分离胶,4%,浓缩胶,1,30% Acr 0.8% Bis,2.0ml,0.33ml,2,pH 8.9 Tris -HCI,1.25ml,-,3,pH 6.7 Tris- HCI,-,0.63ml,4,TEMED,2.5ul,2.5ul,5,10%AP,50ul,12.5ul,6,H,2,O,1.65ml,1.5ml,总体积,约,5 mL,约,2.5 mL,B,加样：各步骤留样的样液；层析后的蛋白峰。,样品的处理：样品加等量的,40%,蔗糖溶液,、,一滴,0.1%,溴酚蓝。,加样量：,20,l,样品,+ 5,(,.,C,电泳：点样端负极，恒压,，,开始,80V,，待样品进入分离胶后,120V,。,电极缓冲液：,pH 8.3 Tris Gly,D,染色：脱色考马斯亮兰,R-250,，,过夜,。,E,脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇,=75,：,875,：,50,）脱色,1h,。,【,结果与分析,】,