HIV抗体检测技术简介 深圳市疾病预防控制中心艾滋病防治科 王晓辉

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HIV抗体检测技术简介 深圳市疾病预防控制中心艾滋病防治科 王晓辉 2021年4月29日,1,HIV 1+2,抗体检测依据,卫生部?关于颁发全国艾滋病检测工作标准的通知?卫疾控发1998第28号,2,HIV,抗体检测实验室种类和分级,1.,种类：确证实验室：抗体确证中心、确证实验室,初筛实验室：初筛中心和初筛实验室。,分级：省级,HIV,抗体确证中心，在市、县区卫生防疫站或有关系统中设立,HIV,抗体确证、初筛中心和初筛实验室。,3,HIV,抗体初筛实验室任务,作HIV抗体初筛检测，并提供检测前、后的咨询效劳。,及时将初检阳性的标本送HIV抗体初筛中心实验室，再转送确证实验室确证。,作好初检标本登记、实验记录，每月5日向当地的HIV抗体初筛中心实验室报告HIV抗体检测情况。,4,HIV,抗体确证实验室任务,承担卫生部和省卫生厅指定区域HIV抗体确证任务。,承担局部HIV抗体初筛任务。,及时向省级HIV抗体确证中心和同级卫生局报告确证的阳性结果。,按月向省HIV抗体确证中心报告HIV抗体检测工作情况。,5,HIV,抗体检测实验室必备条件,人员条件：人数、职称、从事血清学检验经历、培训、复训,设备条件,实验用房或检测操作区间；,仪器设备；,使用高敏感度和特异度的初筛、确证试剂；,要建立血清库,6,HIV,抗体检测实验室的审批和管理,广东省实行,HIV,抗体检测实验室资格审批制度,从事,HIV,抗体检测工作人员必须要有上岗合格证,未经审批的实验室和人员不得开展,HIV,抗体检测工作,7,HIV,抗体检测实验室的审评,省卫生厅成立广东省,HIV,抗体检测初筛实验室资格审评组,审评组的职责：对申报,HIV,抗体检测初筛实验室的单位进行现场考核、技术论证和评价；对,HIV,抗体检测初筛实验室的工作进行技术指导和考核；为全省,HIV,抗体检测工作和实验室建立及管理提供咨询和建议,审评组的常规组织工作委托广东省,HIV,抗体检测确证中心负责。,8,9,10,艾滋病检测方法,一、HIV抗体检测,1.HIV抗体初筛检测:ELISA法、颗粒凝集法、免疫斑点法、放,射免疫法,2.HIV抗体确证检测:免疫印迹法WB、条带免疫印迹法,LIA、免疫荧光法IFA、放射免疫沉淀法RIPA。,二、艾滋病的病原学诊断,1.HIV抗原P24 和逆转录酶RT检测；,2.病毒培养;,3.基因诊断:探针杂交、nt-PCR、HIV RNA定量RT-PCR、,bDNA、NASBA,11,HIV抗体初筛检测,一、HIV抗体检测要求:,1.实验室:HIV抗体检测初筛和确证实验室须分别经省级卫生行政,部门和卫生部考核、审评和批准前方可从事艾滋病检测工作:,2.检测场所：符合?全国艾滋病检测工作标准?的要求；,3.人员:经国家或省级艾滋病抗体检测学习班培训;,4.试剂:批批检合格、进口许可证、生物制品检定所检定、在有效期内的HIV-1/2混合型试剂；,5.保密:初筛检测的阳性结果不是最终结果,必须经确证试验由,HIV抗体确证实验室出具阳性报告才具有法律效应,且须由卫生,行政部门选择适当方式和时间通知其本人及其家属,不得向无关人员透露有关情况,感染者档案以机密形式专人负责管理;,12,6.标本运送和保存:及时别离血清(浆)、无变质、无污染、无溶血。,7.天气炎热、路途较远时应低温用带盖不易破损容器专人运送，,8.并详细填写送检单；城区24小时、农村48小时内送确证实验室,9.并及时报辖区卫生防疫站。,13,HIV抗体检测,HIV感染后的“窗口期Window period：,指从HIV感染后到用现有方法能检出HIV病原体HIV抗原或核酸和/或抗体前的这段时间。,血清阳转Seroconversion：,随着感染的过程进展，HIV抗体浓度或滴度随之增多，血清HIV抗体由阴性转为阳性，这个过程称之。,个体差异、检测方法的种类和试剂的敏感性是影响“窗口期长短主要因素。通常情况下，病毒别离培养和PCR法检测HIV RNA的“窗口期约为7天左右；检测P24抗原的“窗口期约为14-21天；检测抗体的“窗口期约为31-60天。尽量缩短“窗口期，提高检测方法的灵敏度对于HIV感染的早期诊断，特别是在献血员的筛查，防止病毒传播方面具有重要意义。目前许多试剂生产商已成功研制开发出能同时检出HIV抗原和抗体第四代诊断试剂，并开始进行商业化生产和推广应用。,14,哪种情况下需要进行,HIV,检查,1、有高危行为者：如不平安性行为、卖淫嫖娼、吸毒者；,2、不平安受血或血制品使用史者，接受器官移植手术者；,3、HIV感染者/AIDS病人密切接触者及经常接触这类患者的医护人员或实验室工作人员；,4、有以下临床病症或体症者：,1反复而持续性的低热、腹泻；,2不明原因的体重下降；,3浸润性宫颈癌年轻女性；,4中青年出现严重疱疹病毒感染，且治疗效果不佳；,5局部或全身性念珠菌、真菌感染口腔、肠道、呼吸道、中枢神经,系统、外阴或阴道等、CMV感染等；,6弓形体脑病、隐球菌性脑膜炎、年轻人不明原因失明、失忆、智力,障碍等；,7严重进展迅速的结核杆菌感染；,8反复发作的肺部炎症、PCP等。,9皮肤癌、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、严重毛囊炎等。,15,常用的,HIV,抗体初筛检测方法,一、颗粒凝集法,原理：将可溶性HIV抗原吸附或偶联至无关载,体颗粒上，使之成为致敏载体颗粒，与待,检标本中HIV抗体结合，出现肉眼可见的凝,集现象。HIV抗原通常为完整病毒裂解产物、,基因重组或合成多肽抗原成分，常用的无关,载体为RHO型人红细胞和动物绵羊、兔、,鸡 等红细胞、活性炭或硅酸铝颗粒、聚,丙乙 烯乳胶颗粒、明胶颗粒等。,16,PA,定性试验,C,对照颗粒,S,致敏颗粒,M,阴性颗粒,17,PA,定量试验,C,对照颗粒,S,致敏颗粒,M,阴性颗粒,18,19,颗粒凝集法的特点和适用范围,1,.,操作简便，快速，通常在1-2小时时,间报告结果，适于大规模普查。,2.,整个实验在18-25室温下完成，无,需洗涤和任何仪器特别适合于基层卫,生单位、野外或紧急情况的,HIV,抗体检,测。,3,.,价格低廉。,4,.,特异性，敏感性较好。,20,快速试剂和PA的应用,偏远地区,急诊,临床高危,职业暴露,临产,21,二、酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,简介：,酶联免疫吸附试验简称酶标法，是根据酶免疫测定原理开展的一种技术，目前已广泛用于各种抗原和抗体的检测，也是最常用的HIV抗体检测方法。近年来随着生物技术的不断开展，众多试剂生产商对检测方法的多个环节从技术上进行改进和完善，目前已推出第四代HIV抗体ELISA检测试剂，但其根本方法分三类：间接法、双抗原夹心法和抗原竞争法。,22,HIV,抗体测定,HIV,抗体试剂盒进展,代次抗原方法检测时间,1全病毒间接 2个月,2 重组或多肽 间接3-4 周,3 重组+多肽夹心4-7 天,4抗原+抗体夹心抗原 5,pg,23,HIV,抗体测定,特点,第一代全病毒,HIV-1,型,第二代重组/蛋白/多肽联合,HIV-2,型,敏感度同第一代，特异度提高,第三代重组/蛋白/多肽 间接法改为直接法,除,IgG,外能检出早期,IgM,缩短窗口期,24,第四代HIV抗体试剂的特点,抗原抗体联合检测不能取代血液单个抗原的筛查前者抗原检测范围20-100pg/ml，后者3.5-15pg/ml，增加假阴性,在急性感染期单一P24测定较第四代试剂检出早1-2天,第四代试剂在HIV-1非B亚型、O型和HIV-2的敏感度差异较大,由于参加检测抗原的抗-24抗体可减少单一第三代HIV抗体试剂的敏感度,可能会增加非特异性反响的危险性第三代假阳性率0.2%增至0.3%-0.8%,在检测程序上凡第四代阳性，要进行抗原的证实试验,核酸测定比抗体提前11天,1998年Bernard Webur首先评估了第四代试剂平均减少4天窗口期,25,酶联免疫吸附试验影响因素,1.反响温度：ELISA实验一般在3540度，在一定范围内，提高温度可以,加快抗原抗体的结合率。,2.反响时间：在ELISA测定中，抗原或抗体被包被在固相的外表，抗原,抗体反响只能在固相外表附近进行，远离固相外表的物质要靠浓度差,的改变缓慢地参与反响，所以在37度条件下需要12小时才能到达反响平衡，在操作时一定要使各步反响到达足够的时间。,3.样本参加量：加样量太少使敏感性下降和产生误差；加大样本量在一,定范围内可提高敏感性，但有可能使特异性下降。要注意检查加样器,的精确度。,4.酶稳定性：酶结合物在冻干或浓缩状态下可以在较长时间内保持稳定，稀释后滴度下降较快。试剂盒应在有效期内使用。,5.交叉反响性：加样或分血过程中血样的交叉污染可导致假阳性反响。,6.“灰区反响:将OD值在Cut-Off10%范围内的样本称之。此类样本应该高度重视并进行复检，以便于发现早期感染者。,26,HIV,抗体初筛检测的局限性,1.阳性反响样本不能确证，需用本法和其它方法复检，如仍为阳性，需确证试剂进一步确证。,2.阴性结果不能排除HIV感染：HIV感染后血清阳转前,的“窗口期，HIV抗体检测为阴性，晚期艾滋病患者,某些抗体如P24等可能检测不到。此外反响中抗,体量过多，抗原抗体比例不适而不能形成特定的结,合，而出现凝集抑制。,3.可能出现假阳性或假阴性结果：了解试剂供给商因,其使用抗原和包被方法技术存在一定差异。,4.不能诊断6的样本绝大局部为,阳性。,30,HIV,抗体确证检测,HIV抗体确证是目前国际上通用的对样品中血清学检测HIV 抗体阳性结果的最终评价。它是应用高特异性试剂来证实和判断HIV抗体初筛阳性反响是由于真的HIV-1和/或HIV-2感染引起，还是由于非特异性交叉反响或与HIV感染无关的其它因素所致。根据国家卫生部规定，HIV抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确证实验室出具才有法律效应。,常用的HIV抗体确证实验方法有免疫印迹法Western Blot，WB，条带免疫印迹法Strip Immunoblot Assay 或 Linear Immunoblot Assay，SIA 或LIA，免疫荧光法Immunofluorescence Assay，IFA和放射免疫沉淀法Radioimmunopreciptation Assay，RIPA。其中以WB法最常用，而后二种在我国极少使用，在此不作详细介绍。,31,免疫印迹实验WB,原理：HIV-1纯培养物经灭活和裂解处理后在SDS-PAGE凝胶上电泳，不同分子量的HIV-1抗原在凝胶中的泳动速率不同而被别离。通过电转移等方法将凝胶中的抗原转印至硝酸纤维素膜上如为HIV-1/2混合型试剂还需在硝酸纤维素膜上的适当位置喷涂基因重组或合成的HIV-2抗原多肽，含HIV抗原的条膜与适当比例稀释的待检血清浆样品共同孵育，如样品中含有HIV-1和/或HIV-2特异性抗体那么与条膜 上一定位置的相应HIV抗原分子结合，在膜上形成HIV抗原-HIV抗体复合物。洗涤除去未结合物质，参加酶标记抗人免疫球蛋白，形成HIV-抗原-HIV抗体-酶标记抗人免疫球蛋白复合物，再次洗涤后参加反响，在HIV抗体与相应HIV抗原分子结合位置处出现肉眼可见的呈色条带。,32,HIV抗体确证实验结果评价1,阳性：至少一条env带(gp41、gp120、gp160)和一条pol带p65、p51,p32。,至少一条env带和一条gag带p55、p24、p18。,至少一条env带和一条gag带和一条pol带。,至少两条env带。,阴性：无上述反响条带,可疑：只有gag带和pol带，无env带,33,HIV抗体确证实验结果评价2,HIV抗体不确定或可疑结果的评价：,在某些情况下，有些初筛阳性或阴性样品的HIV抗体确证实验可出现不典型的HIV抗体反响性条带图谱，既不能确定为阳性也不能确定为阴性，称为HIV抗体不确定Indeterm