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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,SNPs,的检测方法,唐敏,1,主要内容,SNPs,的定义,SNPs,的研究意义,SNPs,的研究进展和方向,SNPs,的检测方法,2,SNPs,的定义,定义：单核苷酸多态性(,single nucleotide polymorphisms,SNPs),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的,DNA,序列,多态性,。(99.9%),3,SNPs,的研究意义,1.,SNPs,作为第三代,遗传标记,（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_,路标的作用,传统研究策略（表征、蛋白、基因）,逆向遗传学（表型、基因、蛋白），,4,2.基因多态性研究,研究,SNPs,本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）,5,SNPs,研究进展和方向,1.,SNPs,数据库的构建发现,2.,SNPs,功能的研究（在1的基础上）,6,SNPs,检测方法,1.理想的检测,SNPs,的方法,发现未知,的,SNPs，,或,检测已知,的,SNPs,(1)灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）,(2)快速、简便、高通量,(操作和分析的自动化程度高）,(3)费用相对低廉,7,2.现状：,到现在,还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。,8,3.,每种,SNPs,的检测方法都可将之看成由,区分,SNPs,特异位点的原理方法,和,数据的检测分析手段,两部分组成。,9,SNPs,检测方法的分类,一、区分,SNPs,位点的方法,1.基于杂交的方法,2.基于酶的方法,3.以构象为基础的方法,4.直接测序的方法,二、检测分析技术,1.凝胶分析技术,2.荧光检测技术,3.,DNA,芯片,4.质谱检测技术,10,1.,基于杂交的方法,原理:,短的核苷酸,探针,在和互补的,目的片段,进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据,杂交复合体稳定性的不同,而将,SNPs,位点检测出来。（差异越大，检测的特异性就越好）,11,1）,利用,Tm,固定,温度,等位基因特异核苷酸探针,(Allele-specific oligonucleotide，ASO,)。,修饰过的探针：引入一个错配的碱基、,PNA,、,LNAs,等,动态,的加热过程 动态等位基因特异杂交,(dynamic allele-specific hybridization,DASH,),12,核酸肽探针（,Peptide nucleic acids，PNA,),其骨架是肽键,特点：,1、,与靶分子高特异性地结合,（3个方面的影响）,2、链挤入（形成三链复合结构）（,表达调控以及反义治疗方面）,3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（,体外应用）,13,1、与靶分子高特异性地结合,Tm,值高,受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）,Tm,更大（,一个,PNA,碱基的错配会使其,Tm,值降低8-20度）,所以，,PNA/DNA,的非特异结合能得到很好的排除。,14,LNA(locked nucleic acids),其结构是在,RNA,分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。,特点：,1.能以很高的亲和性和互补的,DNA、RNA,或,LNA,结合（,构象更利于杂交的稳定）,2.匹配和不匹配的,Tm,增加,15,DASH,(dynamic allele-specific hybridization,）,16,2）杂交+,荧光共振,分子信标（双分子间杂交）,蝎状探针（分子内杂交）,17,分子信标（,Molecular beacons）,18,蝎状探针（,Scorpion primer）,19,2.,基于酶的方法,1）,DNA,聚合酶,2）,连接酶,3）,限制性内切酶,4）,外切酶,FEN,5）,RNase H,20,1）DNA,聚合酶,等位基因特异性,PCR,多重等位基因特异性,PCR,Taqman,法,引物延伸法,焦磷酸测序法,21,等位基因特异性,PCR,22,Taqman,法,23,微测序法/引物延伸法,24,基本步骤（液相）,1.设计,PCR,扩增含,SNPs,位点的一段,DNA,2.,对,PCR,产物进行纯化（去除引物和,dNTP),3.,引物延伸,4.延伸产物检测（,放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液,相色谱法等）,25,APEX,(,arrayed primer extension),固相,26,焦磷酸测序法(,Pyrosequencing),DNA,聚合酶、,ATP,硫酸化酶(,ATP sulfurylase,)、,荧光素酶(,luciferase,),和三磷酸腺苷双磷酸酶(,apyrase)。,原理：,DNA,聚合酶在一种,dNTP,的存在下进行引物延伸反应,而,引物的成功延伸,将伴随,焦磷酸的释放,焦磷酸在,荧光素酶,的存在下能引一种发,化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。,27,基本步骤,1.,测序引物和,DNA,模板杂交（,PCR,扩增的、单链的），与酶和底物孵育。,2.,四种,dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）,之一,被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，,dNTP,的焦磷酸基团（,PPi）,释放出来。,3.一系列的酶学反应，发出,可见光信号,。,每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。,4.,ATP,和未掺入的,dNTP,由,三磷酸腺苷双磷酸酶,降解，淬灭光信号，并再生反应体系。,5.然后加入下一种,dNTP。,28,29,2)连接酶,联合链式反应,(combined chain reaction,CCR,),连接-滚环扩增反应,(ligation-rolling circle amplication,LRCA,),30,
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