《氨基酸纸层析》PPT课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2024/10/5,1,实 验 一,氨基酸纸层析,2024/10/5,2,1,、通过氨基酸的分离，学习并,掌握纸层,析的原理和操作技术；,2,、掌握分配层析法；,3,、掌握影响分配系数的因素。,一、实验目的：,2024/10/5,3,层析技术,(,chromatography,色谱技术,),一、发展史,：,层析分离技术在,20,世纪初就已得到应用：,1903,年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为,“,色谱法,”,1931,年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；,1944,年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；,20,世纪六十年代末出现了高效液相色谱,(HPLC),。,2024/10/5,4,二、定义,层析技术,是根据被分离的混合物中各组分的,理化性质,（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为,固定相,；另一相流过固定相，称为,流动相,）中进行分配。,层析的基本概念,2024/10/5,5,固定相,：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。,流动相,：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。,柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,层析的基本概念,2024/10/5,6,三、层析技术的种类,1,、按流动相的状态分类：,（,1,）液相层析（色谱）（,2,）气相层析（色谱）；,2,、按固定相的使用形式分类：,（,1,）柱层析（,2,）纸层析（,3,）薄层层析；,3,、,按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：,（,1,）吸附层析（,2,）,分配层析,（,3,）离子交换层析,（,4,）凝胶层析（,5,）亲和层析等。,2024/10/5,7,纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的,分配层析,。,滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为,固定相,，通常把有机溶剂作为,流动相,。,将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点,二、实验原理,:,2024/10/5,8,分配层析法：,利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的,分配系数,是一个常数。,溶质在,固定相,的浓度,(Cs),分配系数,=,溶质在,流动相,的浓度（,Cl),2024/10/5,9,溶剂系统：正丁醇：甲酸：水,=15,：,3,：,2,固定相,：,水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成,固定相,;,流动相,：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成,流动相。,由于混合液中各种氨基酸的,值不同，所以移动速率（即,迁移率,R,f,值,）就不同，从而达到分离的目的。,2024/10/5,10,移动速率,(,比移值,),：,原点到层析点中心的距离,R,f,=,原点到溶剂前沿的距离,2024/10/5,11,影响,R,f,值的主要因素：,R,f,决定于被分离物质在两相间的分配系数以及,两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体,积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物,质分配系数不同，,R,f,也就不同。,（,1,）物质的结构和分子极性：,物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也,就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间,的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，,R,f,小；反之,R,f,则较大。,2024/10/5,12,（,2,）层析溶剂：,首先，溶剂的纯度要高。,其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的,R,f,在,0.05,0.85,。,再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇,-,甲酸,-,水系统久放易引起酯化。,（,3,）,pH,值：,溶剂、滤纸和样品的,pH,值都会影响物质的解离，从而影响物质的,极性和溶解度,，使,Rf,改变；,2024/10/5,13,（,4,）滤纸：,层析滤纸由高纯度棉花制成，,要求滤纸要清洁,，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，,R,f,也不同；,另外，滤纸的杂质也会影响,R,f,，必要时进行预处理（可用,0.01,0.4M,的,HCl,处理除去金属离子）,.,2024/10/5,14,（,5,）室验室的温度和时间,:,温度影响物质在两相中的溶解度，即影响,分配系数,；,也影响滤纸纤维的水合作用从而影响,固定相的体积,；也影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例,。,层,析必须在恒温条件下进行。,2024/10/5,15,（,6,）展开方式：,上行法,R,f,小；,下行法,（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）,R,f,大,；,环行法,（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，,R,f,较小。,（,7,）样品溶液中杂质：,如氯化钠的存在会影响氨基酸的,R,f,值。,2024/10/5,16,1,、实验材料：,谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品,2,、仪器：,(1),毛细管,(2),电热吹风机,(3),层析缸,(4),层析滤纸,(5),小型玻璃喷雾器,(6),铅笔、直尺等。,3,、试剂：,(1),氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、,组氨酸标准品。,(2),溶剂系统：,正丁醇：甲酸：水,=15,：,3,：,2,（体积比）摇匀；,(3),显色剂：,0.25%,的茚三酮丙酮溶液。,三、实验材料、仪器和试剂：,2024/10/5,17,1,、样品的准备：,称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各,1mg,混合溶于,10%,异丙醇中，,0.01M,。,2,、滤纸的准备：,取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿,2cm,处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔,2cm,画一个,“,+,”,作为点样位置，共,5,个点。,四、实验步骤：,2024/10/5,18,2024/10/5,19,3,、点样：,用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个，每点一次用晾干后再点下次，点样点的直径应控制在,2mm,左点样点重复点,5,次,右，点样完毕用大头针将滤纸做成,筒形,，点样面向外。,2024/10/5,20,2024/10/5,21,2024/10/5,22,4,、展层：,向层析缸中加入层析溶剂，,液面不要超过点样线,，（高约,1.5cm,，约,50ml,溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出冷风吹干。,5,、显色,：,用喷雾器将,0.25,茚三酮显色剂,均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。,2024/10/5,23,五、实验结果与计算：,1,、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；,2,、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算,各种已知氨基酸和未知氨基酸的,R,f,值,。,3,、分析混合样品中未知氨基酸的组分,。,2024/10/5,24,2024/10/5,25,六、思考题：,1,、分析影响分配系数的因素有哪些？,2,、何谓分配层析法，分配系数？,3,、,茚三酮丙酮溶液的作用机制？,七、,思考题答案,1,、答：质量比和,pH,都有影响。当萃取剂浓度、组成、水相成分以及温度等改变时，分离系数就要发生变化。,2024/10/5,26,七、,思考题答案,2,、答：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,使之分离。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以,K,表示。,2024/10/5,27,七、,思考题答案,2024/10/5,28,3,、,氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。,