课题资料演示

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,欢迎各位专家光临,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究,课题鉴定,验收资料汇编,二00五年十二月,目 录,一、,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的,实验研究,课题摘要,二、,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的,实验研究,课题工作报告,三、,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的,实验研究,课题技术报告,四、文献综述,五、主要完成单位及完成人员,六、科技查新报告,七、已发表的论文,八、附图,课 题 摘 要,一目的,：,检测内皮型一氧化氮合酶（,eNOS,）,和诱导型一氧化氮合酶（,iNOS,）,在绒毛膜癌、子宫肌瘤、子宫颈癌及卵巢癌组织中的表达情况，探讨一氧化氮合酶在妇科肿瘤发生、发展中的作用,。,二方法,选取临床病理资料172例分为四组：其中子宫颈癌51例；绒毛膜癌24例；卵巢癌55例；子宫肌瘤42例，各组均采集其相对应的正常组织标本共计130例作为对照（子宫颈组织50例；绒毛组织22例；卵巢组织50例；子宫平滑肌组织8例），应用免疫组化的方法，观察,eNOS,、,iNOS,在四种妇科肿瘤组织中的表达。,三、结果,1、,eNOS,、,iNOS,蛋白在四种妇科肿瘤组织中均有不同程度的表达，均显著高于其正常对照组织。,2、,eNOS,、,iNOS,蛋白在子宫颈癌组织中的表达与宫颈癌的病理分级有关（,P0.05）,随着宫颈癌分级的升高而呈上升趋势。,3、在子宫肌瘤中,eNOS,、,iNOS,蛋白相比，,eNOS,的表达显著高于,iNOS,（P0.05）。,四结论,1、一氧化氮合酶蛋白的表达与四种妇科肿瘤组织有关，它们可能在四种妇科肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。,2、,NOS,可望成为早期诊断子宫颈癌的检测指标之一，也可望利用,NOS,抑制剂来治疗宫颈癌。把测定,NOS,作为判断宫颈癌细胞分化程度的一个参考指标。,课题工作报告,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的实验研究,一、课题研究的目的意义,肿瘤是危害人类生命健康极大的特殊疾病，目前全世界每年死于癌症的近1千万人，60以上的患者在初次确诊恶性肿瘤的时候就已经发现有转移，因此，提出寻找肿瘤形成的原因成了世界所关心的课题。在女性生殖系统疾患中，妇科肿瘤的发生率占有一定的比例，严重威胁着广大妇女的健康，其中子宫颈癌、绒毛膜癌、卵巢癌、子宫肌瘤是比较常见的妇科肿瘤,。,这些肿瘤由于确切病因不明，发病机理不清，因而，临床治疗效果还不十分理想。因此，探讨肿瘤发生、发展的致瘤因素已具有十分重要的意义。近十多年来，随着分子生物学的飞速发展，使,NO,成为肿瘤病因学研究的热点。一氧化氮合酶（,nitric oxide,synthase,NOS）,是催化一氧化氮（,nitric oxide，NO）,生物合成的酶，也是内源性,NO,合成的关键酶。,已知,NOS,按调节方式分为结构型一氧化氮合酶（,cNOS,）,和诱导型一氧化氮合酶（,iNOS,）,两种类型，其中,cNOS,又包括神经型一氧化氮合酶（,nNOS,）,和内皮型一氧化氮合酶（,eNOS,）,两种。,cNOS,为细胞本身所固有，在生理条件下受钙离子钙调蛋白系统调节，合成少量,NO，,主要参与机体正常生理功能的维持，发挥调节血管口径、通透性、传递细胞信息等生物学作用。,iNOS,则主要存在于诱导活化的巨噬细胞，非依赖于钙离子钙调蛋白系统，在生理条件下,iNOS,不表达活性，在乏氧、炎症（如细菌脂多糖,LPS,）、,细胞因子（,TNF、IL,1,、INF-a,等）作用下,iNOS,诱导生成,NO，NO,产量大，具有重要的杀菌、抗病毒以及杀肿瘤细胞活性，参与了抗肿瘤免疫过程。,NO,可能促瘤生长作用的原因有三点：,1.低氧上调,iNOS,表达，,NO,在内皮细胞中诱导有丝分裂，在癌细胞中诱导血管内皮生长因子的表达和促进肿瘤新生血管的形成。因此，,NO,促瘤生长作用原因之一可能与血管形成因子有关。,2.,NO,是强有力的血管舒张剂，,NO,促瘤生长作用原因之二可能是,NO,及其产物引起肿瘤组织血流或血管通透性增加，血流的加快和血管通透性提高增加了肿瘤的养分和加快了代谢废物的清除，从而加快了癌细胞的生长和基质细胞的生长。,3.,NO,还可以通过抑制免疫系统和促进局部组织的诱变性促进局部肿瘤的生长。因此，,NO,在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。,本课题从蛋白水平上探讨了,NOS,在四种妇科肿瘤的发生、发展中发挥的作用，为将来利用,NOS,抑制剂防治妇科肿瘤提供理论基础，应用基因疗法彻底根治妇科肿瘤指明了方向,。,二、课题的内容,本实验共分4组：（1）绒毛膜癌及对照组织46例；（2）子宫肌瘤及其对照组织50例；（3）子宫颈癌及其对照组织101例；（4）卵巢癌及其对照组织105例每一蜡块连续切片3张，一张做,HE,染色，其余两张分别用于,eNOS,、,iNOS,染色。免疫组织化学染色，采用常规的,SP,法。每次染色设置阳性、阴性对照。仔细观察每张切片中,eNOS,、,iNOS,蛋白阳性细胞的表达及分布情况，仔细观察每张切片的病理特点，并且作好记录。最后进行统计学处理。,三、技术路线及实施过程,(一)标本来源及筛选,全部妇科肿瘤及对照组标本均来源于甘肃省定西地区医院1993年3月2002年10月，经手术切除并备有完整临床资料的病理科存档蜡块，共计302块。从中筛选出实验组标本172例，其正常对照组织总共130例。所有妇科恶性肿瘤患者术前未接受放疗、化疗或其它特殊治疗，子宫肌瘤患者术前三个月未服用过激素。,（二）,临床病理资料,24例绒毛膜癌全部为妊娠性绒癌，临床分期为期者9例，期者6例，期者6例，期者3例；42例子宫肌瘤中，病理组织类型为肌壁间子宫肌瘤者28例，浆膜下者7例，粘膜下者7例；51例子宫颈癌中，病理分级为级者10例，级者16例，级者25例；临床分期为期者18例，期者12例，期者9例，期者12例。55例卵巢恶性肿瘤中，组织类型为浆液性乳头状囊腺癌者16例，粘液性乳头状囊腺癌者19例，卵巢转移癌者14例，卵巢颗粒细胞癌者6例。,（三）药品与试剂,1、兔抗人,NOS2,多克隆抗体：,Boster,Biotechnology Com LTD,2、,兔抗人,NOS3,多克隆抗体：,Boster,Biotechnology Com LTD,3、DAB,显色试剂盒：福州迈新生物有限公司,4、,SP,试剂盒：福州迈新生物技术开发公司,（四）主要仪器和设备,1、光学显微镜及显微照相系统：日本,Olympus,公司,2、切片机：德国产,AQ820,3、,台式恒温震荡器（,TH2-82A）：,上海跃进医疗器械厂,4、台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂,5、恒温孵箱、湿盒、微波炉等,（五）实验方法,本实验共分4组：（1）绒毛膜癌及对照组织46例；（2）子宫肌瘤及其对照组织50例（3）子宫颈癌及其对照组织101例；（4）卵巢癌及其对照组织105例；每一蜡块连续切片3张，一张做,HE,染色，其余两张分别用于,eNOS,、,iNOS,染色，采用免疫化学染色法，即常规的,SP,法，仔细观察每张切片的病理特点，并且作好记录。每次染色设置阳性、阴性对照,。,（六）结果判定标准,eNOS,、,iNOS,蛋白染色的阳性信号均为细胞浆内出现均匀一致或细颗粒状的棕黄色染色。根据阳性细胞数占细胞总数的百分比及显色强度分为4个等级：无阳性细胞或阳性细胞数极少，无色者为阴性（一）；阳性细胞数50%，呈棕黄色者为强阳性（+）。,（七）统计学方法,：,将结果进行22或,RC,联表的,x,2,检验或者四格表确切概率法，,P0.05,为差异有显著性，统计应用,SPSS10.0,统计软件在微机上完成,。,四、,课题的进度,本课题共分五个阶段：,（一）第一阶段（2001.92001.10）：进行文献检索、设计、制定研究课题，并阅读国内外相关文献，其中英文17篇，中文73篇，共计90篇。在此期间，撰写文献综述1篇，科研论文1篇。,（二）第二阶段（2001.112002.12）：收集、筛选、确定了子宫颈癌、绒毛膜癌、卵巢癌、子宫肌瘤手术后标本172例及其对照组织130例，将这些标本进行登记制表。订购试剂，撰写技术项目申请报告，做预备实验及部分正式实验,。,。,（,三）第三阶段（2003.12003.2）：继续做正式实验。对所选四种妇科肿瘤组织及其对照组织进行,HE,染色、,eNOS,、,iNOS,蛋白的免疫组化染色，在光学显微镜下对染色结果进行仔细观察，并对每一例标本的染色结果做好详细的记录，制定统计图表，对实验数据进行统计学处理。,（四）第四阶段（2003.32003.4）：撰写项目技术资料初稿。,（五）第五阶段（2003.52003.9）：对初稿进行两次修改，审核定稿，打印技术项目申请报告,。,五、应用前景及社会经济效益分析,本课题采用细胞生物学检测技术免疫组织化学（免疫组化）方法，从蛋白水平上探讨与这四种妇科肿瘤致瘤因素相关的指标 一氧化氮合酶，通过对一氧化氮合酶的两种同工酶,eNOS,、,iNOS,进行检测，掌握它们在四种妇科肿瘤组织中的表达特点，进一步为临床防治这四种妇科肿瘤提供理论依据，也为将来应用基因疗法治疗这四种妇科肿瘤指明方向，有潜在的社会效益和经济效益，可望在不久的将来利用一氧化氮合酶的抑制剂治疗这四种妇科肿瘤，为临床新药的开辟提供方向，为妇科肿瘤患者的疾苦作出贡献,。,六、,课题经费预算与用途,（一）购买试剂：免疫组化试剂10000元，一般试剂4000元。,（二）复印及打印费：2000元。,（三）切片劳务费：4000元。,（五）技术项目评审费：2000元。,（六）其它：5000元。,上述各项费用共计27000元。,七、课题承担单位简况,定西市人民医院始建于一九五0年，经过五十年的发展，已成为医疗、教学、科研、预防、急救为一体的综合性医院。近年来，医院相继引进了美国,GE9800,全身,CT，,德国西门子彩超等现代化医疗设备，拥有高中级专业技术人员160多人，参与了一项国家“八五”攻关课题，部分项目已达到全省领先水平,。,课题组成员简况,本课题技术指导王丽京教授，兰州大学生命科学院博士，兰州医学院硕士研究生导师。项目负责人陈芳兰同志系王丽京教授的硕士研究生，1989年,从,兰州医学院毕业，分配到定西市医院工作，2002年取得硕士学位，已具备承担科研项目的实力，于2004年12月晋升为妇产科副主任医师。其余主要完成人员名单依次如下：郭碧莲，1994毕业于兰州医学院，本科学历，1999年10月晋升为妇产科主治医师。李淑梅、孙风副主任医师，本科学历。还有师金梅、孟萍等4名同志参与，都具有丰富的临床经验和扎实的理论基础，以上同志均为妇产科的业务骨干,。,一氧化氮合酶与妇科肿瘤关系的,实验研究,课题技术报告,一氧化氮合酶是催化内源性一氧化氮生物合成的关键酶。由于一氧化氮对肿瘤的影响具有致瘤及抗肿瘤的双向作用，故人们对一氧化氮合酶、一氧化氮的研究方兴未艾。,近年来，有关,NOS,在体内外肿瘤组织中表达的研究报道很多。体外实验发现，一些动物肿瘤模型及人肿瘤系均有,NOS,表达，而且在人肝癌、脑肿瘤、肺鳞状细胞癌、食管癌、膀胱癌、乳腺及前列腺等的肿瘤中发现,NOS,活性增高。,有关系统地研究,NOS,在四种妇科肿瘤组织中表达的研究报道却未见到,1、 国内外研究现状,1、有人用分光光度计检测了42例卵巢肿瘤中,NOS,活性，显示卵巢恶性肿瘤的发生与,NOS,的活性有关，且,NOS,随分化程度的降低而呈升高趋势,2、,Sanyal,等采用免疫细胞化学的方法检测了绒癌细胞株（,JEG3）,及正常位置胎盘滋养细胞中,NOS,的表达，结果显示,eNOS,、,iNOS,完全缺如，只有,nNOS,存在。其原因可能是,Sanyal,等研究的是体外培养的绒癌细胞株的缘故,。,国内目前尚未发现一篇有关,NOS,与绒癌相关的研究报道；有关,NOS,与子宫肌瘤的研究报道亦未见到。,2、关键技术,2.1,HE,切片形态学观察：实验的每一蜡块连续切片3张，一张做,HE,染色，其余两张分别用于,eNOS,、,iNOS,染色。仔细观察每张切片的病理特点，并且作好记录。,2.2免疫组织化学染色：每次染色设置阳性，阴性对照。采用常规的,SP,法，具体方法如下:,(1)切片65,0,G,烘烤72小时后浸入新鲜二甲苯15,min2,(2),梯度酒精各5,min,至水,(3) 0.01,mol,/LPBS,洗5,min3,(4)3%H,2,O,2,封闭内源性过氧化酶10,min,(5)PBS,洗5,min3,(6),加入复合消化液置37,0,G,恒温箱15分钟，以充分暴露组织中的抗原。,(7),PBS,洗5,min3。,(8),正常山羊血清封闭细胞中非特异性抗原，减少非特异性着色，室温下孵育10分钟，,PBS,洗一次即可。,(9)加入第一抗体兔抗人,NOS2、NOS3,多克隆抗体，温盒内4,0,G,冰箱过夜,(10)4,0,G,冰箱取出后，室温下复温1小时。,(11),PBS,洗5,min3,(12),加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟。,(13),PBS,洗5,min3,(14),加入链霉素抗生物素蛋白过氧化酶溶液，室温下孵育10分钟。,(15),PBS,洗5,min3,(16),加入新鲜配制的3,3二氨基苯二胺（,DAB）,底物溶液，室温避光显色3040分钟，镜下控制反应时间，流水冲洗终止反应。,(17)苏木素复染，自来水冲洗，盐酸酒精分化数秒。,(18)自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。,2.3、对照观察,1、阴性对照：用,PBS,代替一抗作为阴性对照。,2、阳性对照片由武汉博士德公司提供的乳腺癌阳性片。,3、技术研究的内容,3.1 一氧化氮合酶在绒毛膜癌及正常绒毛组织中的表达,统计学分析显示：绒毛膜癌组与对照组间,eNOS,蛋白阳性表达率有显著性差异（,2,=5.122727，P 0.05）。,镜下可见,eNOS,蛋白表达主要位于细胞浆，呈棕黄色,。,如下表1：,组 别 例 数,eNOS,表达,阳性率,- + + + + + + （%）,对 照 组 22 18 4 0 0 18.18,绒毛膜癌 24 12 4 7 1 50.00,iNOS,蛋白表达也位于细胞浆，只是染色强度较弱而已。阳性情况见表2。统计学分析显示：绒毛膜癌组与对照组间,iNOS,蛋白阳性表达率有显著性差异（,2,=5.517919，P 0.05）。,表2,组 别 例 数,iNOS,表达,阳性率,- + + + + + + （%）,对 照 组 22 21 1 0 0 4.55,绒毛膜癌 24 15 9 0 0 37.50,3.2一氧化氮合酶在子宫肌瘤及正常平滑肌组织中的表达,在子宫肌瘤组织中，,eNOS,阳性表达的细胞主要分布在肌瘤组织的中央，呈局灶性分布，其染色较强，呈棕黄色细颗粒状。,iNOS,的分布特点基本类似于,eNOS,，,只是染色强度较弱。结果见表3,表3,组别 例数,eNOS iNOS,阳性数 阳性率% 阳性数 阳性率%,子宫肌瘤组 423583.33 25 59.52,正常对照组 8225.00 1 12.50,X,2,值 9.046 4.218,P,值 0.005 0.05,35例,eNOS,阳性表达的子宫肌瘤组织中，,iNOS,阳性表达者为25例，经统计学处理，两者有显著的相关性（,P0.05）,见表4。,表4,eNOS iNOS,合计,阳性 阴性,阳性 25 10 35,阴性 1 6 7,3.3一氧化氮合酶在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达,eNOS,蛋白阳性的细胞主要分布于癌巢组织中，呈强阳性表达，免疫细胞无,eNOS,蛋白阳性表达。,iNOS,阳性的细胞分布基本与,eNOS,蛋白的一致，只是表达强度较弱而已，,eNOS,、,iNOS,在子宫颈癌组织的表达率明显高于其正常对照组织（,P,均,0.01），见表,5,表5,组别 例数,eNOS,表达,iNOS,表达,- + + + 阳性率(%) - + + + 阳性率（%）,宫颈癌组 51 6 8 11 26 88.23 10 27 8 6 80.39,对照组 50 30 15 5 0 40.00 40 7 3 0 20.00,在不同病理分级中，经,RXC,联表的,x,2,检验，,eNOS,、,iNOS,各组间比较,P,均,0.05。具体结果见表6,。,表6,类型 例数,eNOS,表达强度,iNOS,表达强度,- + + + - + + +,病理分级,G1,G2 26 6,3,5 12 9 10 4 3 G3,25 0 5 6 14 1 17 4 3,临床分期,期,期,30 4 5 8 13 6 15 5 4,期,期,21 2 3 3 13 4 12 3 2,3.4一氧化氮合酶在卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达,检测显示：,eNOS,、,iNOS,蛋白表达在卵巢癌组织中均明显高于正常对照组织（,P,均,0.05。,结果见表7,表7,类别 例数 *,eNOS,*iNOS,阳性率(%) 阳性率(%),对照组 50 5（10.00） 0（0）,卵巢癌组 55 40（72.73） 25(45.46),组织类型,浆液性乳头状囊腺癌 16 13(81.25) 9(56.25),粘液性乳头状囊腺癌 19 11(57.89) 6(31.58),卵巢转移癌 14 10(71.43) 6(42.86),卵巢颗粒细胞癌6 6(100.00) 4(66.67),技术研究结论,4.1绒毛膜癌组研究结论,eNOS,、,iNOS,蛋白的高表达与绒毛膜癌的发生、发展有关，它们可能在绒毛膜癌的发病机制中发挥一定的作用。,eNOS,、,iNOS,在早孕正常绒毛组织中的弱表达，说明由它们催化生成的,NO,量较少，这些,NO,可能与早孕正常绒毛组织的生理功能有关。,eNOS,、,iNOS,在绒毛膜癌组织中的高表达，间接反映了滋养叶细胞中生成的,NO,含量较高，这些,NO,可能通过某些途径发挥了致瘤与促瘤生长的作用，至于通过哪条途径发挥作用，值得进一步探讨,。,4.2子宫肌瘤组研究结论,结果说明,eNOS,和,iNOS,的过表达与子宫肌瘤的发生、发展有关，它们可能在子宫肌瘤的发病机制中起一定的作用。本研究还显示,eNOS,与,iNOS,的阳性表达相比，二者有显著的相关性,P0.05），,与宫颈癌的病理分级有关（,P0.05）,随着宫颈癌病理分级的升高而呈上升趋势。这说明,eNOS,、,iNOS,与肿瘤细胞的分化程度有关，分化越差的肿瘤细胞,NOS,的表达越强，我们可以把测定,NOS,作为判断宫颈癌细胞分化程度的一个参考指标。,4.4卵巢癌组研究结论,eNOS,、,iNOS,在卵巢恶性肿瘤组织中的表达均明显高于正常卵巢(,P,均,0.05），这表明,eNOS,、,iNOS,仅仅参与了卵巢癌的发生、发展过程，在决定卵巢癌的组织类型等方面没有发挥重要作用。卵巢恶性肿瘤组织中,NOS,表达增高是,NO,合成增多的重要原因之一，也是促进肿瘤发生及生长过程中的一个重要环节。,综上所述,eNOS,、,iNOS,蛋白在四种妇科肿瘤组织中均有不同程度的表达；它们可能在四种妇科肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用；,NOS,可望成为早期诊断子宫颈癌的检测指标之一，也可作为判断宫颈癌预后的指标。经甘肃省医学情报研究所查新检索（报告编号：6203262005392）：有关应用免疫组化,SP,法检测子宫肌瘤、绒毛膜癌组织中内皮型一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶的研究，国内未有文献报道；有关子宫颈癌的国内虽有相关报道，但研究的内容和结果不完全相同；有关卵巢癌的虽有相关的文献报道，但所用方法与本课题不同。,5、项目的创新点,1、在选题方面,本课题采用免疫组化技术，对子宫颈癌、绒毛膜癌、卵巢癌及子宫肌瘤四种组织中,eNOS,、,iNOS,进行综合检测，研究分析，对单肿瘤单因素的研究方法进行了改进。,2、在研究层次上,本课题从蛋白水平上对四种妇科肿瘤组织中的一氧化氮合酶的两种同工酶（,eNOS,、,iNOS,）,进行了检测，与传统研究肿瘤的方法（大体器官学、细胞结构,HE）,相比，层次上更进了一步。,3、研究结果显示,四种肿瘤组织中,eNOS,、,iNOS,均有不同程度的表达，表达趋势为子宫颈癌最高，子宫肌瘤、卵巢癌次之，绒毛膜癌最低；子宫颈癌中,NOS,的表达与宫颈癌的病理分级有关，与临床分期无关，随着病理分级的升高，,NOS,的表达呈上升趋势。换言之，宫颈癌的恶性程度越高（细胞的分化程度越低），,NOS,的表达越强。,4、研究得出的结论,NOS,可望成为早期诊断宫颈癌的检测指标之一，也可望成为判断宫颈癌分化程度的一个参考指标，也可望利用,NOS,抑制剂来治疗宫颈癌。,5、国内相关研究方面,NOS,与子宫肌瘤和绒毛膜癌的相关性研究国内未见报道，仅为本课题研究内容。,致谢：,本课题是在各级领导的关心和支持下完成的。在课题鉴定之际，本组成员谨向所有的领导和同仁们表示衷心地感谢,！,