基因工程-2-载体

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒载体,载体,噬菌体载体,动物病毒载体,大肠杆菌质粒载体,pBR322,单链,DNA M13,载体,SV40,载体,乳头瘤病毒载体,昆虫杆状病毒载体,柯斯,(COS),载体,噬菌体载体,枯草杆菌质粒载体,pNC3,酵母菌质粒载体,2,农杆菌,Ti,质粒载体,Ti,一 基因工程的基本元件,-,载体,四、,E.coli,质粒载体,1.pBR322,是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称,.,pBR322,的构建,复制子,:,松弛型,选择标记,:Amp,、,Tet,筛选形式,:,抗性插入失活,单一切点,:24,个,物理图谱,pBR322,的特性,pBR322,plasmid,F.Bolivar,R.L.Rodriguez,Bacterial Resistance,pBR322,酶切图谱,2.pUC,系统,美国加利福尼亚大学的科学家,J.Messing,和,J.Vieria,于,1987,年首先构建,来自,pBR322,质粒的复制起点,氨苄青霉素的抗性基因,大肠杆菌,-,半乳糖酶基因的启动子及其编码的,-,肽链基因（,lacZ,）,位于,lacZ,基因内的一段,MCS,区段,2.pUC,系统,X-gal,溴氯吲哚,+,-,半乳糖苷,-,蓝白斑筛选,插入片段 无酶活性 白斑,未插入片段 有酶活性 蓝斑,-,半乳糖苷酶,3.TA,载体,经,Taq DNA,聚合酶扩增后的,PCR,产物末端都带有单个,A,酵母菌质粒载体,食品级微生物,适合于真核基因表达,基因产物外分泌,七、酵母菌质粒载体,多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链,DNA,，称为,2,质粒，长约,6.3kb,，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（,ARS,片段）。,整合型、复制型、附加型和稳定型,等类型。,含有,E.coli,质粒的复制起始序列。,含有酵母的筛选标记（如,LEU2,）,具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。,2.,酵母菌质粒载体的特点,1.,酵母菌质粒载体的类型,Type,Name,Description,bacterial origin,ColE1,ColE1(pUC-type)origin of replication,promoter,Gal1-10 promoter,Gal1-10 yeast promoter,selectable marker,ampR,ampicillin resistance gene,selectable marker,chlR,chloramphenicol resistance gene LOST in recombined(with insert)form,selectable marker,URA3,URA3 auxotrophy selectable marker(yeast),yeast centromere,CEN4,yeast centromeric sequence,yeast origin,ARS1,ARS1 yeast origin of replication,酵母菌,稳定型,质粒载体,着丝粒,第二节 噬菌体载体,一、,噬菌体载体,1.,噬菌体结构特点:,线性双链,DNA,分子,可在,E.coli,中大量繁殖,具非必需区(约1/3长度）,两端具12个核苷酸单链互补粘性末端,噬菌体线性,DNA,分子的粘性末端及其环化作用,（,a,）具有互补单链末端（粘性末端）的,DNA,分子。,（,b,）当进入宿主细胞后，通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫做,cos,位点,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,T,A,C,G,cos,5,-P,5,-P,3,3,粘性末端,环化作用,（,a,）,（,b,）,2,、,噬菌体的缺陷与改造,噬菌体的缺陷：,酶切点太多,5,个,BamH1,位点，,6,个,Bgl,位点，,5,个,EcoR,位点。,野生型只能接纳一定长度的,DNA,。,噬菌体的,75-105%,，只能接纳,49kb,5%=2.45kb,的,DNA,。,噬菌体的改造：,切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（,15-23Kb,）；,去除过多的酶切位点，每种酶只留,1-2,个切口；,增加选择标记基因（,selectable marker,）；,建立,DNA,的体外包装。,主要外壳蛋白质是基因,E,的产物,头部前体,连环,DNA,基因,A,的产物在,cos,位点切割噬菌体,DNA,包含在外壳中的基因,D,的产物,基因,W,和,FII,的产物组装蛋白质加完整的尾部,噬菌体的包装过程,sup,-,细菌,头部基因（琥珀突变型）,尾部基因（琥珀突变型）,转录复制蛋白质合成,组装尾部所需要的组分,“,无头部,”,的提取物,组装头部所需要的组分,“,无尾部,”,的提取物,温育,完整的噬菌体,转录复制蛋白质合成,T4,噬菌体的体外包装,DNA,的体外包装,体外包装的重组,DNA,比裸露的,DNA,导入受体细胞的效率高,100-10000,倍,4.,凯伦噬菌体载体克隆过程,5.,噬菌体载体优点:,用途:,主要用于建立真核生物的基因文库,感染高效:比质粒高百倍,容量大:可达15,Kb(,不得超过原来长度的105%,不得短于原来长度的7,5%),易操作,易保藏,二、,柯斯(,COS),载体(,cosmid),1.柯斯载体的组成,带有抗药性标记,带有质粒的复制起始点,带有多个限制酶的单一切点,带有,噬菌体粘性末端片段,由质粒和,粘性末端“尾巴”两部分组成。,2.,柯斯载体的特点,3.cosmid,载体的优点,能象,DNA,一样体外包装，并高效导入受体细胞,可以装载比质粒或,DNA,大得多的外源,DNA,片段,cos,区,1.7 kb+,质粒部分,3.3kb 46.5Kb,外源,DNA,由于携带质粒的选择标记，便于筛选,由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序,三、,M13,噬菌体克隆载体,1.M13,的特性,:环状,单链,DNA,6.407Kb,2.M13,噬菌体作为载体,优越性,单链,DNA,噬菌体的复制，是以双链环形的,DNA,为媒介的，这种复制形式的,DNA,简称,RFDNA,；,不论是,RFDNA,还是,ssDNA,都能感染大肠杆菌；,单链,DNA,噬菌体颗粒的大小，是受其,DNA,的大小制约的，不存在包装限制问题；,可产生含外源片断的单链,DNA,分子。,2.M13,载体的构建,五、噬菌体展示载体,其基本原理是将外源,DNA,片段插入噬菌体编码蛋白基因,P,中，使外源,DNA,片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。,质粒,噬菌体,柯斯质粒,单链噬菌体,克隆,DNA,大片段,*,+,+,-,构建基因组文库,-,+,+,-,构建,DNA,文库,+,-,-,-,常规的亚克隆化,+,-,-,-,构建新型的,DNA,结构,+,-,-,-,序列分析,+,-,-,+,单链探针,-,-,-,+,外源基因在大肠杆菌中的表达,+,-,-,-,*,外源,DNA,如超过,10kb,，则重组质粒的转化率和,DNA,得率都非常低,四种常用载体的比较,