质粒的酶切—_琼脂糖凝胶电泳分离DNA

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,实验目的,实验原理,实验仪器、材料与试剂,实验步骤,实验结果及讨论,实验目的,限制性内切酶切割出目的,DNA,了解琼脂糖凝胶电泳的原理,掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法,实验原理,利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒,DNA,。,琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的,DNA,（如用肉眼观察，可检测到,10 ng,的,DNA,），且检测的范围很广。,pBC SK map,它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当,DNA,样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入,DNA,分子中形成络合物，使,DNA,在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于,DNA,的含量，这样就可以检测,DNA,的浓度。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器,1.,水平式凝胶电泳槽,2.,稳压电泳仪,3.,电炉,4.,紫外检测仪,5.,台式离心机,（二）材料,实验一中提取的质粒,DNA,和酶切后的质粒,DNA,。,（三）试剂,1.,限制性内切酶,Eco,RI,，,2.TAE,电泳缓冲液,(50),（,pH8.0,）,Tris 242g,冰醋酸,57.1ml,0.5mol/L EDTA,（,pH8.0,）,100ml,3.,溴化乙锭溶液,10mg/ml,水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。,4.10DNA,样品上样缓冲液,5.,琼脂糖,实验步骤,酶切体系,调制酶切体系如下,:(,共,20L),无菌水,6L,，,质粒,10 L,Buffer K 2L,Eco,R I 1L,BamH,I 1 L,37,酶切,1.5,小时。,琼脂糖凝胶制备,1.,洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。,2.,插好挡板、梳子。,3.,根据实验所需称取,0.4,克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入,40ml,电泳缓冲液（,1TAE,）。,4.,加热煮沸，使琼脂糖,完全,溶解。,5.,溶液冷至约,60,时，加入溴化乙锭,4,L(,终浓度为,0.1 g/l),，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。,6.,室温下约,30-45,分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。,7.,加入电泳缓冲液（,1TAE,）至电泳槽中，使液面高于胶面约,1mm,。,8.,在,DNA,样品中加入,2 L(1/10,体积,),的,10 DNA,上样缓冲液,(loading buffer),，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。,9.,用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。,10.,插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至,120V,，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。,11.,等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。,12.,取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。,13.,根据需要切下,DNA,条带，放入,1.5ml Ep,管中，放于,4,保存，以备下周实验用。,实验结果及讨论,质粒,DNA,在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。,如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。,影响,RE(,限制性内切酶,),活性的主要因素：,DNA,的纯度；,DNA,的甲基化程度；温度；缓冲液成分（,DDT,，,BSA,）等。,使用,3 mg,的,DNA Marker DL,2,000,（,500 ng/,条带）进行,1%,的琼脂糖凝胶电泳后，各,DNA,条带自上至下分别为,2kb,，,1Kb,，,750bp,，,500bp,，,250bp,，,100bp,。,