生物样品中药物定量分析的指导原则与实验实施课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/6/30,#,生物,样品定量分析指导原则与实验实施,2015.6.30,方法学确证是整个药代动力学研究的基础,。,所有,药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果,。,通过,准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性,等研究建立了测定方法，得到了,标准曲线,后，在检测过程中还应进行,方法学质控,，制备,随行标准曲线,并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性,。,生物样品中药物定量分析,CFDA,关于相关生物样品定量分析的要求,化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则,化学药物临床药代动力学研究技术指导原则,化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则,9012,生物样品定量分析方法验证指导,原则,生物样品中药物的定量分析,2005,年陆续在相关研究中颁布,中国药典,2015,年版四部,国外相关指导原则,FDA,：,Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation,EMEA,：,Guideline on bioanalytical method validation,生物样品中药物的定量分析,2013,年修订版本,2012,年版本,CFDA,一、指导原则解读,范围,生物分析,方法验证,2.1,分析方法的完整验证,2.1.1,选择性,2.1.2,残留,2.1.3,定量下限,2.1.4,标准曲线,2.1.5,准确度,2.1.6,精密度,2.1.7,稀释可靠性,2.1.8,基质效应,2.1.9,稳定性,2.2,部分验证,2.3,交叉验证,3.,试验样品分析,3.1,分析批,3.2,分析批的接受标准,3.3,校正范围,3.4,试验样品的重新分析和报告值选择,3.5,完整性,3.6,用于评价方法重现性的试验样品再分析,EMEA,一、,指导原则解读,2.1.1,选择性,2.1.2,残留,2.1.3,定量下限,2.1.4,标准曲线,2.1.5,准确度,2.1.6,精密度,2.1.7,稀释,可靠性,2.1.8,基质效应,2.1.9,稳定性,FDA,一、指导,原则解读,1.,范围,测定对象确定,生物基质中的药物浓度。,适合于非临床或临床试验样品实际分析的基本要求。,规定,部分验证,或,交叉验证,的适用范围。,一、指导原则解读,2.1,完整验证,每个物种和每种基质进行完整验证。,难以获得相同基质，可以采用适当基质替代并给出理由。,完整,验证包括：,选择性、定量下限、响应函数和校正范围、准确度、精密度、基质效应、分析物的稳定性。,2.,生物分析方法验证,对照标准物质,对照标准物质的,溶液,+,空白生物基质,=,校正标样,色谱法需要使用,内标,对照标准物质需要提供：,分析,证书、储存条件、失效日期、批号。,内标：,证明可适用，即无干扰。,2.,生物分析方法验证,质谱分析推荐使用同位素内标,区分目标,分析物,和,内标,与基质的,内源性组分,或样品中,其他组分（代谢产物或共同服用的其他药物）,。,6,个不同来源的空白基质分别分析。,如,有干扰,，则干扰的峰面积小于,LLOQ,的峰面积的,20%,，小于内标峰面积的,5%,，可以接受。,2.1.1,选择性,在新药研究中需要按照要求在报告上提供相应数量的典型色谱图,J. Wen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43 (2007) 655658,如果待测组分是内源性成分？,Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159,样品处理用的水及流动相中不含有,I,空白生物样品中的,I,属于内源性物质,空白生物样品标准添加,I,依旧可以测定,如果待测组分是内源性成分？,添加,LLOQ,浓度,添加,MQC,浓度,实测样品,1.,证明处理溶剂（包括流动相）中未有需要测定的成分,2.,证明内源性成分存在测定成分,3. LLOQ,添加图谱显示添加测定成分后，峰面积增加，并辅以数据说明（标准曲线）,Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159,如果存在外源性非测定成分影响？（例如中西药合并给药）,C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 4856,空白血浆,苯丙胺,盐酸伪麻黄碱,苯海拉明,空白血浆,+,生姜提取物,充分考察同时给药的成分是否会影响待测成分的专一检测,C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 4856,0.5ng/ml,1.0ng/ml,4.10 ng/ml,14.05 ng/ml,空白血浆,+,标准样品,给药速效抗晕胶囊后,24h,血样浓度,前一,针进样的残留对后一针进样的干扰。,一般多发生在高浓度进样后。,先进一针工作曲线的最高浓度，再紧接着进一针空白，观察是否有干扰，干扰峰面积,小于,LLOQ,的峰面积的,20%,，小于内标峰面积的,5%,，可以接受,。,如干扰，需要消除。,2.1.2,残留,犬血浆中的盐酸克伦特罗的测定,空白样品；,B. 0.1 ng/ml,标准血浆；,进样,10 ng/ml,标准血浆样品后进样的空白样品,残留,洗针的溶剂、次数；提取溶剂；复溶比例等重新优化,能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。,是标准曲线的最低点。,应该满足预期的浓度与实验目的。,准确度应,在标示值的,+/-20,%,范围,内。,变异系数不得超过,20%,。,2.1.3,定量下限,指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度。,制备各个浓度的校正标样,基质相同。,每个分析批都应该有一条标准曲线。,6,个校正浓度水平,+,空白样品,+,零浓度样品,（空白,+,内标）,验证中需要评价,3,条标准曲线。,回,算浓度应该在标示值的,+/-15%,，,LLOQ+/-20%,之内,回算浓度偏差,=【,（实测值标示值）,/,标示值,】X100%,2.1.4,标准曲线,绘制工作曲线,评价干扰,当线性范围较宽的时候，推荐采用,加权的方法,对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确,。即,低浓度点满足回算的要求。,2.1.4,标准曲线,权重,浓度,峰面积比,1,1/x,1/x,2,10,0.102,139.7,117.7,103.6,20,0.139,112.9,102.3,97.6,50,0.241,92.6,88.7,89.5,100,0.443,93.3,91.7,94.8,200,0.862,95.3,95.0,99.2,500,2.284,104.3,104.7,110.1,1000,4.309,99.2,99.8,105.2,INTERCEPT,0.0419,0.05178,0.06014,SLOPE,0.004301,0.004265,0.00404,R,2,0.9991,0.9991,0.9942,准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近,程度。,校正标样,绘制工作曲线。,质控,样品,评估准确度。,用,4,个浓度评价,定量,下限,低浓度,QC,LLOQ,的,3,倍以内,中,浓度,QC,标准曲线中间浓度,高浓度,QC,标准曲线上限的,75%,2.1.5,准确度,二者需要分别配制，即储备液不相同,+/-20%,+/-15%,批,内准确度：,1,个分析批进行验证,，每个浓度至少,5,个样品。,批,间准确度：,3,个,分析批进行验证，且至少进行,两天,，每个浓度至少,5,个样品。,2.1.5,准确度,分析物重复测定的接近程度。,测量,值的相对标准偏差（变异系数）。,采用与准确度验证相同的分析批结果进行计算。,4,个浓度验证。,定量,下限变异系数不超过,20%,。,其余浓度点不超过,15%,。,2.1.6,精密度,判断样品稀释后是否会影响定量的准确度和精密度。,配制高于定量上限浓度的样品。,用空白基质稀释该样品。,每个稀释因子至少测定,5,个数据，其准确度和精密度应在,+/-15%,之内。,2.1.7,稀释可靠性,质谱方法应该考察基质效应。,采用至少,6,批来自不同供体的基质，不可以合并基质。,选择高、低两个质控浓度进行。,求,算不同浓度的基质因子。,计算,内标归一化基质因子,=,分析物基质因子,/,内标基质因子,变异系数,15%,2.1.8,基质效应,空白血浆沉淀蛋白,标准溶液,浓度,C,纯净溶液,浓度,C,QC,血浆沉淀蛋白,浓度,C,Set 1,Set 2,Set 3,最终进样检测浓度相同,基质因子,100%,Set 2,Set 1,基质因子的,计算,J. Wen et al. / J. Chromatogr. B 867 (2008) 153159,选择结构类似的化合物为内标可以很好的消除基质效应的影响，应用峰面积比值进行定量，其基质效应约为,100%,分析物基质,因子,内标基质,因子,内标归一化基质,因子,选择低浓度和高浓度质控样品进行验证。,预处理后或者在相应条件储存后立即分析得到该条件下数据。,制备随行标准曲线，求算上述质控样品的浓度，与标示浓度比较，均值应与标示浓度的偏差在,+/-15%,之内。,【,不是比较色谱峰面积,】,2.1.9,稳定性,稳定性的考察,时间尺度,应该不小于试验样品的储存时间及相应条件下的处理方式或时间。,分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性。,基质中分析物冷冻和融化稳定性。,基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性。,处理,过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性。,处理,过的样品在自动进样器温度下的稳定性。,储存,前预处理的基质中分析物的稳定性。,2.1.9,稳定性,储备液稳定性,：,4,度冰箱或者,-20,度冰箱,长期冷冻稳定性,：,-20,度或者,-80,度冰箱,冻融稳定性,：,3,个冻融循环（冷冻,8h,以上）,自动进样器稳定性,：预处理后放置自动进样器上，时间长短与分析批有关,室温稳定性,：室温放置的稳定性，与前处理一个分析批有关,采血后全血稳定性,：与药物是否易降解有关,2.1.9,稳定性,分析方法的转移,仪器的改变,校正浓度范围的改变,样品体积的改变,改变基质或者物种,改变抗凝剂,改变样品处理步骤,改变储存条件,2.2,部分验证,CFDA,：并未给出如何部分验证，究竟应该选择哪些部分验证，因此需要自行判断并说明理由。,EMEA,：部分验证可以少到测定批间精密度和准确度，也可以至几乎全部验证内容。,应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证。,同一,份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评价均值的差异。,质控,样品：,+/-15%,以内,试验样品：,+/-20%,以内,2.3,交叉验证,3.1,分析批,空白样品,零浓度样品,校正标样,至少,6,个（与验证相同）,质控样品,低、中、高,3,个浓度，各,2,份（不少于试验样品总数的,5%,）,-,分散处理,试验样品,3.,试验样品分析,校正标样：,回算浓度偏差在标示值的,+/-15%,以内。,定量,下限,+/-20%,以内,不,少于,6,个标样符合上述要求。校正标样越多，需要,75%,的标样符合,质控样品：,准确度,+/-15%,以内,67%,的质控样品符合,不,符合的应该不在同一个浓度水平,如不符合，重新测试。,3.2,分析批的接受标准,试验样品分析浓度范围比验证时候工作曲线,窄,调整标准曲线范围和质控样品浓度,或者加入新的质控样品浓度,试验样品分析,浓度,高,于定量上限,延伸标准曲线范围，增加额外浓度的质,控,样品,或者改变试验样品浓度（稀释）,至少应该有,2,个质控样品浓度落在试验样品的浓度范围内,改变标准曲线，需要,重新进行方法学验证（部分验证）,3.3,校正范围,事先制定,SOP,确定重新分析的理由和选择报告值的标准，并在报告中提供重新分析的样品数目及比例。,主要理由：,校正标,样或质控样品不合格,内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著,仪器功能异常或者进样不当,高于定量上限或者低于定量下限,空白或安慰剂样品中测到分析物,色谱图难看,3.4,试验样品重新分析和报告值选择,不接受由于药动学行为不佳而重新分析的理由,在,SOP,中应该对,色,谱的,积分和重新积分,进行规定。,任何偏移,SOP,的色谱积分都应该在报告中讨论。,色,谱积分参数、重新积分参数、初始积分结果和调整后的积分结果都需要在实验室存档，并备查。,3.5,积分,在过了若干天后，对试验样品在另外一个分析批进行重新分析，,评价实际样品测定的准确度。,一般重新分析,10%,的样品。,如果样品总数超出,1000,，则超出部分重新分析,5%,。,建议选择消除相和,Cmax,附近的样品再分析。,评价指标,=,（重新测定浓度,-,初始浓度）,/,（重新测定浓度,+,初始浓度）,/2*100%,3.6,用于评价方法重现性的,试验样品再分析,至少,67%,的复测样品的结果在,+/-20%,之内。,以下情况需要再分析：,毒代动力学，每个物种,1,次,关键性的生物等效性试验,首次用于人体或者患者的药物试验,首次用于肝肾功能不全患者的药物试验,3.6,用于评价方法重现性的,试验样品再分析,全部源数据应该以其原始格式保存，并根据要求提供。,应记录任何对验证计划的偏离。,方法验证报告,样品分析报告,5.,试验报告,方法验证报告,样品分析报告,二、分析方法验证实验实施,实验室内部研究一般顺序：,方法的建立和优化,预实验的样品测试,制定方法学研究的方案并实施,储备液，工作溶液，系列工作溶液及生物样品溶液的配制,选择性考察、基质效应考察,3,个分析批次的标准曲线、精密度与准确度考察,稳定性考察,其他可能的考察,药代动力学实验、取样及样品保存,样品测试,+,随行标准曲线及,QC,样品,数据分析,+,复测,数据处理,+,出具报告,文献查阅了解相关内容,1,.,了解分析对象的理化性质，酸碱性、溶解性、稳定性、光学性质等。,2.,了解药物的代谢途径、产物和动力学性质，如吸收、分布、代谢、排泄、结合等。,3.,取样对象：体液，如血、尿等；组织，如肝、脑、胆、毛发等；细胞等等,4.,分析的目的：代谢途径和产物，药动学研究，临床药物监测等。,1.,方法的建立和优化,HPLC,HPLC-MS/MS,分析物的特点,内标的选择,标准溶液进样分析确定基本色谱条件,根据可能的最低浓度确定体外样品能够测定到的最低浓度,综合考虑前处理的方法,1.,方法的建立和优化,液液萃取：干净、可以富集待测成分,蛋白,沉淀：快速、适合浓度较高的生物样品,固相,萃取：纯化效果好、可以富集、适合多成分前处理（多成分的化合物结构、性质差异较大）,用校正样品评价选择性和可能的,LLOQ,评价绝对回收率,【,新的指导原则未提及,】,1.,方法的建立和优化,预实验,一般大鼠选择,46,只，犬选择,2,只,按照实际试验的要求进行给药取血,采用随行标准曲线测定血药浓度,根据预实验结果，确定标准曲线范围，制定分析方法学验证的具体内容,1.,方法的建立和优化,一般在预实验之后,进行基质效应、标准曲线、准确度,、精密度的,考察,（第一天,/,第二天,/,第三天）,分析批次,1,标准曲线,1,，,LLOQ5,，,LQC5,，,MQC5,，,HQC5,分析批次,2,标准曲线,2,，,LLOQ5,，,LQC5,，,MQC5,，,HQC5,分析批次,3,标准曲线,3,，,LLOQ5,，,LQC5,，,MQC5,，,HQC5,3,个分析批获得,3,条,标准曲线,，,15,个,LLOQ,数据，每个分析批,各,5,个的,LQC/MQC/HQC,数据,2.,分析方法验证时间安排,第四天,第六天,完成考察稳定性中除了长期稳定性之外的项目，开始长期稳定性考察（如果不是从第一天考察长期稳定性，则需要重新配制储备液及相应的质控样品）,一般应该在,30,天内完成（该时间长短应该与设计的药代动力学试验吻合）,30,天后，可以开展正式的药代动力学试验。,2.,分析方法验证时间安排,第,1.1,类创新药物,SD,大鼠与犬两种动物,高中,低,3,个剂量，根据药效学试验选择，分别进行药时曲线的绘制,其中,SD,大鼠中剂量,需要进行组织分布、排泄的试验,犬的中剂量,需要进行多剂量的试验,3.,药代,动力学试验,第,1.1,类创新药物,SD,大鼠每个剂量组选择,812,只大鼠，雌雄各半，体重,180220g,。,中,剂量组的组织分布选择吸收相,1,个点、达峰浓度附近,2,个点，分布相,1,个点、消除相,1,个点进行，每个时间点为,6,个大鼠,中,剂量组排泄试验选择,68,只大鼠分别进行粪尿排泄与胆汁排泄,3.,药代,动力学试验,第,1.1,类创新药物,犬每个剂量组选择,6,只，体重,810kg,中剂量,组第一次给药后，连续给药,7,天，取第,4,、,5,、,6,天的谷浓度，以及第,7,天给药前和给药后的各点,3.,药代,动力学试验,动物试验需要注意：,实验动物的生产许可证，发票一致,实验动物的使用许可证,许可证,开具时间一定不能晚于动物试验开始的时间,取血后分离血浆，保存待测。,注意：取血时间到测试时间的长度小于长期稳定性的长度,3.,药代,动力学试验,样品测试按照事先制定的,SOP,进行。,下次内容：,生物等效性与生物利用度试验设计,药,代动力学参数处理与统计分析,4.,样品测试,