微生物检测培训教材课件

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,共标,共知,共通,共协,人,诚,品,高 嘉士利,-,利万家,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,微生物培训教材,制 作 人： 罗蝶影,制作日期：,2015,年,4,月,1,日,微生物检测,一般企业自检的微生物检验项目,主要有：,菌落总数,大肠菌群,霉 菌、酵母菌,微生物名词解析,菌落总数,食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和时间）培养后，所得每,检样中形成的微生物菌落总数（,单位为,cfu/g,）。,主要反映食品的新鲜度、被细菌污染的程度以及在加工过程中细菌繁殖状态，是判别食品卫生质量的依据。,从食品卫生观点看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，病原菌污染的可能性越大。,但是菌落少不能代表食品质量好，曾报道，市面上售出的一批冰蛋制品中，检出菌落总数在,5000cfu/g,以下的样品和菌落总数在,380cfu/g,的样品中，均可分离出,沙门氏菌,（,致病菌,）和测出大肠菌群。,一些菌落总数低的食品（,如腌制品,），曾有细菌繁殖并产生毒素，由于食品环境限制细菌生长，但毒素因性状稳定不受影响，仍在食品保留。,微生物名词解析,大肠菌群,大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。,主要来源为人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。,它反映了食品是否被粪便污染，同时推断食品中是否有肠道致病菌污染的可能。,食品中的大肠菌群数是每,100g,检样内大肠菌群最可能数（,The most probable number,，简称,MPN,）表示，即,MPN/100g,（,2003,年版本,）,微生物名词解析,霉菌、酵母菌,霉菌和酵母菌广泛存在于环境中，在食品中可以作为正常菌相的一部分或作为空气传播性污染物。部分加工食品中允许霉菌的存在。,饼干霉菌,50cfu/g,，月饼霉菌,100cfu/g,。,各类食品遭受霉菌和酵母菌的侵袭，常常发生霉坏变质，其有毒代谢物引起各种急性和慢性中毒，特别是一些霉菌毒素具有强烈的致癌性（如,黄曲霉毒素,）。,实验证明，一次大量摄入或多次少量摄入，皆能诱发癌症。已知产毒霉菌类型有青霉、曲霉和镰刀霉等。,霉菌和酵母菌是每,1g,检样中所含霉菌和酵母菌菌落总数。 （,单位为,cfu/g,）,检测对应培养基,菌落总数,-,平板琼脂,-GB 4789.2-2010,食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定,大肠菌群,-,乳糖胆盐,- 4789.3-2003,食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数,生活水质大肠菌群,-,乳糖蛋白胨,-GB 15979-1995,一次性使用卫生用品卫生标准,霉菌、酵母菌,-,马铃薯培养基、孟加拉红培养基,-GB 4789.15-2010,食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,生理盐水,-,0.85%,微生物检测方法,谨记一个原则,无菌操作,所有检验操作尽量减少被细菌污染的可能性，检验前，无菌室、操作平台和空间必须经过灭菌，所有与样品接触的用具均要经过灭菌，食品的外包装也需经过消毒。检验过程要求快速、准确，减少被空气中或检验员自身的物质污染,微生物检测方法,一）样品分类,大样：一整批样品。,中样：整批样品中采集代表性混合样品，一般约为,200g,。,小样：做分析用样品，也称,“,检样,”,，一般为,25g,。,二）采样工具,药匙、剪刀、采样袋、试管、广口瓶、镊子、棉签， 平皿必须是无菌；,应放在特定容器或用合适材料（如,牛皮纸,、铝箔纸等）,包裹,或,加塞,，保证灭菌效果；,三）无菌室消毒（依据,GB/T 27405-2008,）,紫外线消毒：无菌室保持清洁干燥，作用时间,30min,，关闭紫外灯至少,30min,后，方可入内作业。,臭氧消毒：封闭无菌室，采用,20mg/m,3,浓度，作用时间,30min,，消毒后浓度,0.2mg/m,3,浓度时，方可入内作业。,微生物检测方法,四）灭菌方法（依据,GB/T 27405-2008,）,培养基：,通常使用高压湿热灭菌法,121 15min,，,特殊（如 含糖培养基，,115 ,20min,）。,器具和设备：,湿热灭菌：,高压灭菌锅，,121 20min,，如玻璃器皿、一次性用品等；,干热灭菌：,干燥箱,，,160 2h,，,180 1h,，,适用玻璃器皿、不锈钢用具等；,液体消毒剂消毒：,适量浓度自配消毒剂（如,75%,酒精,），对工作台面、器具或设备表面进行消毒；,PS,：芽孢是最顽强的细菌休眠体，,是灭菌标准的主要依据,，肉毒梭菌的芽孢在,PH7.0,时，,121 ,需,10min,才能杀死，嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢，,121 ,需,12min,才能杀死，因此,规定湿热灭菌在,121 ,下至少,15min,才能算达到无菌要求。,菌落总数测定,搅 拌,1ml,1ml,1ml,稀释度,0.1,稀释度,0.01,固体产品,液体产品,225ml,稀释液,（,0.85%,生理盐水）,25g,25ml,9ml,稀释液（,0.85%,生理盐水）,每个稀释度,2,个平皿,每皿加入,15-20ml,平板琼脂,菌落计数,36 1 ,，,48 2h,混匀、凝固后倒放,报告,菌落总数测定,注意事项,平板琼脂低于,40,度会开始凝固，故使用前需水浴保温在（,46 1 ,） 。,为确保试验结果有效，要有对照平板，观测 生理盐水、琼脂和工作台暴露空气是否无菌和受到污染。平皿加入检液后，应在,20min,内加入琼脂，并混合均匀。,皿内琼脂凝固后，将平皿倒置放入培养箱进行培养，避免菌落蔓延生长及冷凝水落到培养基表面影响菌落形成。,平板培养方法得出的菌落总数，只是检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，培养结果要比食品中实际细菌数少。,习惯进出玻璃瓶或试管时，不要接触到瓶口或试管外侧，避免污染。,吸管插入吸液内不能低于液面,2.5cm,，往试管加液时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液。,培养条件是根据食品种类而定，大部分食品如饼干为,36 1 ,，,48 2h,，特殊如,水产品类用,30 1 ,，,723h,。,菌落总数测定,菌落计数,菌落数,菌落计数,菌落总数,30-300,具体数值,1,个稀释度菌落数在此范围,=,该稀释度平均菌落数,稀释倍数,2,个连续稀释度菌落数在此范围,=,所有平板菌落数之和,（低稀释度平板个数,+0.1,高稀释度平板个数）,低稀释度,30,具体数值,300,多不可计,所有,30,最低稀释度的平均菌落数,稀释倍数,所有,300,最高稀释度的平均菌落数,稀释倍数,所有,=0,1,最低稀释倍数,所有不在,30-300,最接近,30,或,300,的平均菌落数,稀释倍数,菌落总数测定,菌落报告,菌落总数,菌落总数正式书写报告,100,按“四舍五入”，整数报告,100,第,3,位数字采用“四舍五入”，取,2,位数字，后面全用,0,代替，也可用,10,的指数表示，仅留,2,位有效数字,蔓延无法计数,菌落蔓延,空白对照有菌落,此次检测结果无效,菌落总数测定,举例,例次,稀释度及菌落数,菌落总数,报告方式,10,-1,10,-2,10,-3,1,1365,164,20,16400,16 000,或,1.610,4,2,2760,295,46,31000,31 000,或,3.110,4,3,2890,271,60,30091,30 000,或,3.010,4,4,多不可计,4560,513,513000,513000,或,5.110,5,5,27,11,5,270,270,或,2.710,2,6,0,0,0,110,10,7,多不可计,305,12,30500,31 000,或,3.110,4,例,3,：,2,个连续稀释度菌落数在,30-300,之间：,菌落总数,=,（,295,2+46 2,）,（,2+0.1 2,）, 10,-2,）,=31000,混匀,36 1 ,，,18-24h,36 1 ,，,24 2h,搅 拌,固体产品,液体产品,225ml,稀释液（,0.85%,生理盐水）,25g,25ml,乳糖胆盐发酵管,产气,不产气,报告,大肠菌群阴性,革兰氏染色,乳糖复发酵管,伊红美蓝琼脂平板,不产气,报告,大肠菌群阴性,产气,报告,大肠菌群阳性,革兰氏阴性无芽孢杆菌,革兰氏阳性,报告,大肠菌群阳性,36 1 ,，,24 2h,混匀,大肠菌群测定,大肠菌群测定,注意事项,2003,版本的大肠菌群测定法采用,三步法,（,初发酵,、,分离培养,和,证实试验,）。,第一步初发酵是样品发酵的结果，不是纯菌的发酵试验。所以初发酵产气阳性管，经过后面两步法后，可能为阴性。很多实验证明，初发酵产气管，第三步证实试验后可能为阴性。,在伊红美蓝培养基上，要挑取典型、正确的菌落，故需熟悉大肠菌群在伊红美蓝上的菌落形态（如,呈紫黑色有或无金属光泽,、,中心色较深,的菌落）,在初发酵管中，产气量的大小与大肠菌群的检出率呈正相关，有时候套管内无气体，但是在液面或管壁有小气泡缓缓上升，此时我们可以用手轻敲或摇动试管，如果出现有气泡上升，应列为可疑阳性，做进一步的证实试验。,初发酵中出现产酸变色无产气现象，大量试验证明，可能做进一步的证实试验后为大肠菌群阳性。做证实试验时应考虑在内。,大肠菌群测定,MPN,检索表部分截图如下：,MPN,表只提供,3,个稀释度，即：,1ml(g),、,0.1ml(g),、,0.01ml(g),；若改用,10ml(g),、,1ml(g),、,0.1ml(g),，则表内数字相应增加,10,倍。其他同理类推。,MPN,表中提供的稀释度是指原样品的量，而非稀释后的浓度，对固体样品要更加注意。如固体样品,1g,放入,9ml,的生理盐水（,10,倍稀释）后，虽加入,1ml,量样品稀释液，但实际其中只含,0.1g,样品，应按,0.1g,计。,按相应的浓度产生的阳性管，对应,MPN,检索表，查的在,95%,可信度下的大肠菌群最可能数量为,？,MPN/100g,。,举例：,1ml(g),无阳性管,、,0.1ml(g),无阳性管,、,0.01ml(g),出现一支阳性管， 查上表（,MPN,检索表）得出该样品的大肠菌群为,30MPN/100g,。,9,管 法,大肠菌群最可能数,(MPN),检索表,阳性管数,MPN 100ml(g),95%,可信限,1ml(g),3,0.1ml(g),3,0.01ml(g),3,下限,上限,0,0,0,30,0,0,1,30,5,90,0,0,2,60,0,0,3,90,0,1,0,30,5,130,霉菌、酵母菌测定,搅 拌,1ml,1ml,1ml,稀释度,0.1,稀释度,0.01,固体产品,液体产品,225ml,稀释液,（,0.85%,生理盐水）,25g,25ml,9ml,稀释液（,0.85%,生理盐水）,每个稀释度,2,个平皿,每皿加入,15-20ml,马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基,菌落计数,281 ,，,5d,混匀、凝固后倒放,报告,霉菌、酵母菌测定,注意事项,霉菌、酵母菌的检测方法与菌落总数的检测方法大体一样，仅培养基与培养条件不同。,霉菌、酵母菌的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基。,培养条件为,28 1 ,，,5d,。,平板培养方法得出的菌落总数，单位与菌落总数一致，皆为,cfu/g,。,挑选菌落总数在,10-150cfu,之间的平板计数。,若所有平板菌落数,150cfu,，则对稀释度最高的进行计数，取其平均菌落数。其余记为,“,多不可计,”,。,若所有平板菌落数,10cfu,，则对稀释度最低的进行计数，取其平均菌落数。,报告形式,与菌落总数,同理,。,环境微生物监控项目,生产工序监控：,人员手、台面、空间环境,-GB15979,一次性使用卫生用品卫生标准,生产水质,-GB5749,生活饮用水卫生标准,产品监控：,饼干,-GB7100,饼干卫生标准,月饼,-GB7099,糕点、面包卫生标准,微生物检测限值对照,检测项目,内控标准限值,(,可调,),国家标准限值,菌落总数,（,cfu/ml,）,大肠菌群,（,MPN/100ml,）,菌落总数,（,cfu/ml,）,大肠菌群,（,MPN/100ml,）,加工人手表面,200,不得检出,300,不得检出,台面、包材,10,不得检出,20,不得检出,空气,内包区：,1000,其余区：,2000,-,2500,-,生产水质,80,不得检出,100,不得检出,饼干,500,不得检出,非夹心：,750,夹心：,2000,30,月饼,1000,不得检出,1500,30,备注,如下页所示,微生物检测工作详表,监控工序,检验项目,培养基类型,样品数量,培养基总量（,ml,）,使用工具,加工人手表面,菌落总数,平板琼脂,20,800,生理盐水,10ml,试管,20,个、棉签,20,个、平皿,40,个,大肠菌群,乳糖胆盐,20,1000,（单料）,60ml,试管,20,个,装,50ml,台面、包材,菌落总数,平板琼脂,8,320,生理盐水,10ml,试管,8,个、棉签,8,个、平皿,16,个,大肠菌群,乳糖胆盐,8,400,（单料）,60ml,试管,8,个,装,50ml,空气,菌落总数,平板琼脂,4,400,平皿,20,个,生产水质,菌落总数,平板琼脂,4,160,空锥形瓶,4,个，平皿,8,个,大肠菌群,乳糖蛋白胨,4,200,（双料）,400,（单料）,20ml,试管,20,个,装,10ml,、,10ml,试管,40,个,饼干,菌落总数,平板琼脂,10,400,生理盐水锥形瓶,10,个,装,225ml,，平皿,20,个、,剪刀,、,镊子,、,吸管,、,移液枪,、,油性笔、电子称,大肠菌群,乳糖胆盐,10,300,（双料）,600,（单料）,20ml,试管,30,个,装,10ml,、,10ml,试管,60,个,月饼,霉菌,马铃薯葡萄糖或孟加拉红,5,200,平皿,10,个,配制工作,第一步,准备采样工具（棉签、,4,个,250ml,空锥形瓶）和,操作工具,（,10,个药匙、,2,把剪刀、,2,个镊子、吸量管或移液枪吸管）,检验工具,（,104,个平皿）,干热或湿热灭菌,第二步,配制,0.85%,无菌生理盐水,3000ml,（如,8.5g,氯化钠,+1000ml,蒸馏水）,分装,12,个锥形瓶，每瓶,225ml,。,分装,28,支,10ml,试管，每支,10ml,。,121 20min,湿热灭菌,第三步,配制,单料,乳糖胆盐,1400ml,（如,35g,乳糖胆盐,+1000ml,蒸馏水）,分装,28,支,60ml,试管，每支,50ml,。,配制,双料,乳糖胆盐,300ml,（如,35g,乳糖胆盐,+1000ml,蒸馏水）,分装,30,支,20ml,试管，每支,10ml,。,121 20min,湿热灭菌,第四步,配制,单料,乳糖蛋白胨,200ml,（,如,23g,乳糖蛋白胨,+1000ml,蒸馏水）,分装,20,支,20ml,试管，每支,10ml,。,配制,双料,乳糖胆盐,200ml,（如,46g,乳糖蛋白胨,+1000ml,蒸馏水）,分装,20,支,10ml,试管，每支,10ml,。,115 20min,湿热灭菌,第五步,配制平板琼脂,2000ml,（如,23.5g,平板琼脂,+1000ml,蒸馏水）,分装,4,个,500ml,锥形瓶，每瓶,500ml,。,121 20min,湿热灭菌,现场采样工作,第一步,准备采样工具,（棉签、,4,个空锥形瓶、,10ml,无菌生理盐水,28,支,（采样管）,、,225ml,无菌生理盐水,2,瓶,（用于湿润棉签）,）,和,操作工具,（,2,个镊子、,2,个酒精灯、,2,个试管架、,2,个不锈钢方框）,使用前用酒精消毒,第二步,配制,75%,食用酒精,1000ml,（,可用酒精计），分装到,1,个,700ml,玻璃瓶中，和,2,个,200ml,玻璃瓶。,把,2,个不锈钢方框和适量棉球放入酒精内。,酒精会挥发，配制需快速,第三步,员工手指,：把以上工具放入采样篮中，带到生产现场操作。,选定操作台面，先用酒精擦拭台面，把采样工具放在台面，,用棉签湿润生理盐水，后涂抹员工右手曲面，从,指尖到指端,，来回,10,次。去掉手接触部分，放入,采样管,。,员工检验前不可洗手消毒，所有操作需在酒精灯前完成,第四步,操作台面（,包材,）,：把不锈钢方框放在检测台面,（包材）,上，,用棉签湿润生理盐水后，在其内涂抹,10,次。,去掉手接触部分，放入,采样管,。,放入采样管的操作需要在酒精灯前完成,第五步,生产水质,：到检验指定位置，让水自流,5,分钟后，迅速,打开灭菌空锥形瓶，接入约,250ml,水，立刻加塞捆绑。,尽量避免其他污染,微生物培养,培养项目,使用培养基,使用,器具,培养时间,培养温度,计数方式,菌落总数,平板琼脂,2,平皿,482h,36 1,平板计数,大肠菌群,乳糖胆盐,9,试管,242h,36 1,产气管数量,查,MPN,表,水质大肠菌群,乳糖蛋白胨,15,试管,242h,36 1,产气管数量,查,MPN,表,霉菌、酵母菌,马铃薯葡萄糖、孟加拉红,2,平皿,5,天,28 1,平板计数,