DNA提取原理和方法演示课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA extraction,1,细胞内的核酸包括,DNA,与,RNA,两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。,真核生物的,DNA,又有染色体,DNA,与细胞器,DNA,之分。前者为,双链线性分子,；后者为,双链环状分子,。,除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒,DNA,；在非细胞型病毒颗粒内，,DNA,的存在形式多种多样。,DNA extraction,2,极性化合物，溶于水，不溶于,乙醇、氯仿,等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。,在酸性溶液中，,DNA,、,RNA,易水解，在,中性或弱碱性,溶液中较稳定。,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白,(DNP),形式存在于细胞核中。,核酸的理化性质,3,提取,DNA,总的原则,:,1 保证核酸一级结构的完整性；,2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度；,3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,4 其他核酸分子，如,RNA，,也应尽量去除。,4,DNA,提取的几种方法,基因组,DNA,的提取,非基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,断裂成为线状,共价闭合环状结构,5,基因组,DNA,的提取,细胞破碎方法,应用,机械法,1匀浆法,机体软组织,2捣碎法,动物韧性组织,3研磨法,细菌、酵母,物理法,1超声法,细胞混悬液,2反复冻融法,培养细胞,3冷热交替法,细菌、病毒,4低渗裂解,红细胞,化学法,1有机溶剂,细菌、酵母,2,去垢剂,组织、培养细胞,3酶解法,细菌、酵母,根据裂解方式的不同有：,6,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,高盐低,pH,值结合核酸，低盐高,pH,值洗脱。,快捷高效。,低盐高,pH,值结合核酸，高盐低,pH,值洗脱。,适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组,DNA,的提取,7,浓盐法,：,有机溶剂抽提法：,密度梯度离心法：,利用,RNP,和,DNP,在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,基因组,DNA,的提取,8,SDS,法流程图,（以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,基因组,DNA,SDS,法,9,Approximately 1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube;,Add 0.5 ml,tail solution,and 25 ml,Proteinase K,mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;,More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;,Add 0.5 ml,Phenol/Chloroform,and vortex at top speed for 15 min at RT;,Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;,Transfer,the top aqueous phase,to a fresh microfuge tube;,Add 0.5 ml,Chloroform,and vortex at top speed for 5 min at RT;,Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,Transfer,the top aqueous phase,to a fresh microfuge tube,add 50 ml 3 M,NaOAc,(pH=6.0)and 0.5 ml,100%ethanol,invert several times;,A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;,Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,If there is no pellet,place samples in-80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;,Wash pellet once with,70%ethanol,air dry;,Resuspend DNA in ddH2O.,Use 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.,Phenol-chloroform extraction of mouse tail,DNA,10,1.SDS：,十二烷基硫酸钠,2.Tris,：,缓冲液,3.EDTA,2.Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K,mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;,作用：细胞裂解时,PH,值也能稳定,作用：,a.,溶解细胞膜、核膜上脂质成分,b.,使蛋白质变性,作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。,Tail solution:,11,3,.,More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;,Proteinase K:,作用：广谱蛋白酶，能在,SDS,和,EDTA,的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将,DNA,游离。,12,4.,Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;,5.,Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;,优点：,1.,有效变性蛋白质；,2.,抑制了,DNase,的降解作用。,缺点：能溶解,10-15%,的水，从而溶解一部分,DNA,Phenol,：,Chloroform,：,1.,加速有机相与液相分层。,2.,去除,DNA,水溶液中残留的微量酚。,减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。,有助于分相，使离心后的上层含,DNA,的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,Isoamyl alcohol,：,13,7.,Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;,8.,Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min at RT;,9.,Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（,1:1,）使用。,Chloroform,：,14,10.,Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube,add 50 ml 3M NaOAc(pH=6.0)and 0.5 ml 100%ethanol,invert several times;,11.,Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,NaOAc(pH=6.0):,1.,沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间,2.,提供单价阳离子。减少,DNA,分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成,DNA,钠盐沉淀，,100%ethanol,任意比和水相混溶，夺去,DNA,周围的水分子，使,DNA,失水而易于聚合。,但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而,DNA,在溶液中有一定程度的溶解，因而,DNA,损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。,15,12.,If there is no pellet,place samples in-80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;,13.,Wash pellet once with 70%ethanol,air dry;,14.,Resuspend DNA in ddH2O.,DNA,则多以弱碱性的,Tris,或者,TE,溶解。,2.,基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。,DNA,的保存 ：,16,非基因组,DNA,的提取,碱裂解法,密度梯度离心法,煮沸法,质粒,DNA,的提取,17,1,、培养细菌使质粒扩增,-,对数生长后期,2,、收集和裂解细菌,3,、质粒,DNA,的纯化,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,18,1,、培养细菌使质粒扩增,-,对数生长后期,在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌,(,单克隆,),，使细菌快速增殖的同时质粒,DNA,得到大量扩增。,37,o,C,振荡过夜,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,19,2,、收集和裂解细菌,非离子型,/,离子型去污剂,裂解 有机溶剂,/,碱,加热,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,20,3,、,质粒,DNA,的纯化,-,CsCl-,溴化乙锭梯度密度离心,取决于线状,DNA,与闭环,DNA,与溴化乙锭结合的量,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,21,原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,22,离心洗涤,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,质粒,DNA,的提取,-,碱裂解法,23,SDS,碱裂解法提取质粒,DNA,中溶液的成分及作用,溶液,Resuspension Buffer,成分：,50mM,葡萄糖,/10mM EDTA/25mM Tris-HCl,，,pH=8.0,葡萄糖,:,增稠。维持渗透压，防止,DNA,受机械切力作用降解。,EDTA:,二价金属离子的螯合剂，抑制,DNase,的活性。,有利于溶菌酶的作用。,这一步溶液中还可以加入,RNase,溶菌酶：糖苷水解酶。当溶液中,PH,小于,8,时，溶菌酶作用受到抑制。,24,溶液,Lysis Buffer,成分 ：,0.2M NaOH/1%SDS,NaOH,：,溶解细胞，,DNA,变性,SDS,：,(1),溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。,(2),解聚细胞中的核蛋白。,(3)SDS,能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。,SDS,与,NaOH,联用：,增强,NaOH,的强碱性,SDS,碱裂解法提取质粒,DNA,中溶液的成分及作用,25,SDS,碱裂解法提取质粒,DNA,中溶液的成分及作用,溶液,Neutralization Buffer,成分 ：,3M KAc,/2M HAc,KAc :,K+,置换了,SDS,中的,Na+,，得到,PDS,沉淀,HAc :,中和,NaOH,使,DNA,复性,26,吸附柱,Spin Column with Collection Tubes,结构：,特殊硅基质吸附材料，特异性吸附,DNA,，而,RNA,与蛋