EPO工程细胞培养方法和反应器

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,EPO,工程细胞,大,大规模培,养,养方法和,反,反应器,马佳鹏,刘,刘丽,佳,佳,70,期生命科,学,学与技术,基,基地班,沈阳药科,大,大学,1,红细胞生,成,成素,(erythropoietin,EPO),红细胞生,成,成素,(erythropoietin,EPO),是一种糖,蛋,蛋白,它是红细,胞,胞发育成,熟,熟过程中,的,的一种最,重,重要的调,节,节因子,它在治疗,肾,肾衰引起,的,的贫血中,显示明显,的,的疗效和,很,很小的副,作,作用,;,在纠正恶,性,性肿瘤相,关,关贫血、,艾,艾滋病引,起,起的贫血,和,和化疗引,起,起的贫血,等,等方面,也显示乐,观,观的前景,;,还可在手,术,术前作为,自,自体输血,从而避免,感,感染血源,性,性疾病等,等,等。因此,EPO,是很有前,途,途的一种,细,细胞因子,2,rhEPO,的工程细,胞,胞,rhEPO(,人重组红,细,细胞生成,素,素,),的工程细,胞,胞通常使,用,用,CHO,细胞,因为,CHO,细胞是重,组,组糖蛋白,生,生产的首,选,选体系,而,rhEPO,就是一种,糖,糖蛋白,.CHO,细胞是体,壁,壁依赖性,细,细胞,.,3,培养基,微载体,生物反应,器,器,rhEPO,rhEPO,工程细胞,CHO,培养参数,分泌产物,分离纯化,4,培养基,天然培养,基,基,合成培养,基,基,无血清培,养,养基,5,无血清培,养,养基,无血清培,养,养基是在,合,合成培养,基,基内加入,不,不同种类,的,的补充因,子,子而替代,PBS,的培养基,.,它避免了,血,血清培养,基,基污染的,可,可能性,并排除了,批,批次间的,差,差别还减,少,少了纯化,的,的难度,.,但无血清,培,培养基没,有,有广泛的,适,适应性,不同的细,胞,胞甚至不,同,同的细胞,株,株和细胞,系,系有各自,独,独立的无,血,血型培养,基,基配方,.,6,补充因子是无血清,培,培养基中,各,各种血清,替,替代成分,的,的总称。,补,补充因子,的,的种类繁,多,多,主要有生,物,物大分子,、,、小分子,和,和微量元,素,素等。补,充,充因子又,可,可归类为必需补充,因,因子和特殊补充,因,因子。,必需补充,因子,:,胰岛素、,转,转铁蛋白,和,和亚硒酸,钠,钠所有的细,胞,胞株在无,血,血清培养,基,基中生长,时,时都需要,的,的,特殊补充,因子,:,生长因子,激素,贴,贴壁因子,其它补,充,充因子,7,1.,胰岛素,:,细胞无血,清,清培养中,胰岛素的,使,使用浓度,为,为,0.110g,mL-1,。胰岛素,可,可以促进,RNA,、蛋白质,和,和脂肪酸,的,的合成,抑制细胞,凋,凋亡,是重要的,细,细胞存活,因,因子,部分学者,认,认为在批,式,式培养中,胰,胰岛素迅,速,速耗尽是,细,细胞比生,长,长速率下,降,降的主要,原,原因。,CHO,细胞能在,仅,仅含重组,人,人胰岛素,一,一种蛋白,成,成分的无,血,血清培养,基,基中连续,传,传代,8,2.,转铁蛋白,:,大多数哺,乳,乳动物细,胞,胞上存在,特,特定的转,铁,铁蛋白受,体,体,受体与转,铁,铁蛋白,/Fe3+,复合物结,合,合是细胞,获,获取必需,的,的微量元,素,素铁的主,要,要来源,此外转铁,蛋,蛋白还具,有,有生长因,子,子的性质,并,并能与其,他,他微量元,素,素如钒等,结,结合。转,铁,铁蛋白的,使,使用浓度,为,为,0.5100gmL-1,亦有研究,报,报告指出,无血清培,养,养基中必,须,须要有转,铁,铁蛋白至,少,少,5gmL-1,胰岛素才,能,能起作用,。,。也有资,料,料证实转,铁,铁蛋白在,无,无血清培,养,养基中的,作,作用可以,为,为某些铁,盐,盐所代替,如柠檬酸,铁,铁、二甲,胂,胂酸铁、,葡,葡糖酸铁,等,等。,9,3.,亚硒酸钠,:Hewlett,在,1991,年曾指出,硒,硒在任何,一,一种细胞,特别是人,体,体细胞的,生,生长过程,中,中确实具,有,有明显作,用,用,微量元素,硒,硒参与谷,胱,胱甘肽过,氧,氧化物酶,和,和过氧化,物,物歧化酶,的,的作用过,程,程,消除氧化,物,物酶和氧,自,自由基对,细,细胞的伤,害,害。亚硒,酸,酸钠的最,适,适添加浓,度,度是,3060nmolL-1,。,10,生产,rhEPO,的无血清,培,培养基,用于基因,重,重组促人,红,红细胞生,成,成素,(Recombinanthuman erythropoietin,rHuEPO),生产且不,含,含牛血清,白,白蛋白的,无,无血清培,养,养基,-p(Serum free medium-p,SFM-p),培养液,就是在达,尔,尔贝可改,良,良的伊格,尔,尔,(Dulbecco smodifiedEagle smedium,DMEM)F12(11),培养基中,添,添加了,Se,、乙醇胺,、,、多种维,生,生素、蛋,白,白胨、胰,岛,岛素、转,铁,铁蛋白和,一,一些细胞,因,因子等成,分,分构成的,专,专用培养,基,基,11,使用无血,清,清培养基,的,的问题,无血清培,养,养基虽然,在,在各个方,面,面都显示,出,出其强大,的,的优势和,发,发展前景,但采用无,血,血清培养,而,而诱发的,细,细胞凋亡,也,也成为动,物,物细胞无,血,血清培养,技,技术中亟,待,待解决的,问,问题,.,在培养基,中,中加入某,些,些化合物,如金精三,羧,羧酸,(Aurintricarboxylicacid,ATA),、锌离子,、,、抗氧化,剂,剂和细胞,因,因子等,在一定程,度,度上可阻,止,止因采用,无,无血清培,养,养,基而导致,的,的细胞凋,亡,亡,.,12,无血清培,养,养基展望,培养基中,所,所添加的,蛋,蛋白成分,主,主要还是,来,来源于动,物,物或人,仍然存在,病,病毒污染,的,的危险,只有完全,采,采用非动,物,物来源的,材,材料,才是相对,安,安全的,而植物提取,物,物将是理想,的,的选择,.,可以这样,预,预测,未来开发,的,的新一代,无,无血清培,养,养基,将是一种,既,既无血清,、,、无蛋白,又可以高,温,温消毒,且适合于,多,多种不同,细,细胞生长,的,的全能型,培,培养基,13,微,载,载,体,体,微,载,载,体,体,培,培,养,养,是,是,细,细,胞,胞,在,在,由,由,葡,葡,聚,聚,糖,糖,制,制,成,成,的,的,小,小,球,球,表,表,面,面,成,成,单,单,层,层,生,生,长,长,通,过,过,轻,轻,轻,轻,搅,搅,拌,拌,使,使,细,细,胞,胞,维,维,持,持,悬,悬,浮,浮,状,状,态,态,。,。,这,这,种,种,培,培,养,养,较,较,传,传,统,统,的,的,单,单,层,层,细,细,胞,胞,培,培,养,养,面,积,积,大,大,大,大,增,增,加,加,将,这,这,种,种,微,微,载,载,体,体,在,在,流,流,化,化,床,床,式,式,、,、,固,固,定,定,床,床,式,式,反,反,应,应,器,器,中,中,进,进,行,行,培,培,养,养,则,可,可,获,获,得,得,比,比,原,原,来,来,多,多,2050,倍,的,的,高,高,密,密,度,度,细,细,胞,胞,.,14,常,用,用,的,的,微,微,载,载,体,体,15,Cytodex,微,载,载,体,体,上,上,细,细,胞,胞,生,生,长,长,情,情,况,况,16,17,18,19,20,21,Cytopore,的,性,性,质,质,22,动,物,物,细,细,胞,胞,生,生,物,物,反,反,应,应,器,器,23,常,见,见,动,动,物,物,细,细,胞,胞,生,生,物,物,反,反,应,应,器,器,类,类,型,型,气升式,(airlift),生物反应器,中空纤维管,(hollow-fiber),生物反应器,流化床,(fluidiz-bed),生物反应器,(FBR),搅拌罐,(stir-tank),生物反应器,(STR),固定床,(fixed-bed),生物反应器,填充床,(packed-bed),生物反应器,24,填充床生物,反,反应器,动物细胞大,规,规模培养需,要,要合适的生,物,物反应器,.,目前国内用,的,的比较多的,适,适合,CHO,细胞生长并,能,能高效表达,产,产物的反应,器,器是填充床,式,式生物反应,器,器,其中比较有,名,名的是美国,NBS,公司生产的,Celligen,系列,.,25,Celligen plus,Celligen 310,26,Cellgen,系列生物反,应,应器的特点,适合贴壁培,养,养细胞和悬,浮,浮细胞,适合各种动,物,物细胞,昆虫细胞和,植,植物细胞等,灌流式的培,养,养过程,低（无）剪,切,切力搅拌,无气泡通气,；,；,特殊的贴壁,载,载体,比表面积大,静止培养,通过持续检,测,测摄氧率实,时,时检测细胞,浓,浓度,符合现行药,品,品生产质量,管,管理规范,(cGMP),27,灌注培养,灌注属于连,续,续培养,细胞保留在,反,反应器系统,中,中,收获培养液,的,的同时不断,加,加入新鲜培,养,养基,.,灌注培养的主要优点是连续灌注,的,的培养基可,以,以提供充分,的,的营养成分,并带走代谢,产,产物,.,同时,细胞保留在,反,反应器中,可以达到很,高,高的细胞密,度,度,.,同其他方法,相,相比,灌注培养的,产,产率可以提,高,高一个数量,级,级,并可以大大,降,降低劳动力,的,的消耗,.,28,29,Celligen,系列生物反,应,应器的特点,适合贴壁培,养,养细胞和悬,浮,浮细胞,适合各种动,物,物细胞,昆虫细胞和,植,植物细胞等,灌流式的培,养,养过程,低（无）剪,切,切力搅拌,无气泡通气,；,；,特殊的贴壁,载,载体,比表面积大,静止培养,通过持续检,测,测摄氧率实,时,时检测细胞,浓,浓度,符合现行药,品,品生产质量,管,管理规范,(cGMP),30,搅拌叶轮种,类,类,31,Celligen,系列生物反,应,应器的特点,适合贴壁培,养,养细胞和悬,浮,浮细胞,适合各种动,物,物细胞,昆虫细胞和,植,植物细胞等,灌流式的培,养,养过程,低（无）剪,切,切力搅拌,无气泡通气,；,；,特殊的贴壁,载,载体,比表面积大,静止培养,通过持续检,测,测摄氧率实,时,时检测细胞,浓,浓度,符合现行药,品,品生产质量,管,管理规范,(cGMP),32,Celligen,系列使用的,载,载体,Fibra-Cel(,聚酯片,),33,FibraCel,的技术指标,34,FibraCel,的电镜照片,无细胞生长,的,的,FibraCel,HEK293,细胞在,FibraCel,上生长,4,天的情况,HEK293,细胞在,FibraCel,上生长,7,天的情况,35,FibraCel,适用的细胞,种,种类,36,篮式纤维填,充,充床,37,Celligen,系列生物反,应,应器工作原,理,理,(P113),38,用无,血,血清,培,培养,基,基在,填,填充,床,床生,物,物反,应,应器,生,生产,rHuEPO,文摘,在填,充,充床,生,生物,反,反应,器,器用,含,含,5%FBS,的,DMEM:F12,培养,基,基培,养,养产,重,重组,人,人促,红,红细,胞,胞生,成,成素,(rHuEPO),的细,胞,胞,CHO810d,后,使用,自,自制,的,的无,血,血清,生,生产,培,培养,(SFM-p),生,rHuEPO,。,SFM-p,培养,基,基既,能,能维,持,持细,胞,胞生,长,长,又能,生,生产,EPO,也便,于,于纯,化,化分,离,离,rHuEPO,。使,用,用填,充,充床,生,生物,反,反应,器,器培,养,养细,胞,胞,能维,持,持培,养,养,2025d,rHuEPO,表达,水,水平,达,达,12284mg/L,之间,反应,器,器的,产,产率,达,达,71,0mg/L/d,比滚,瓶,瓶的,产,产率,增,