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*,*,*,第,15,课时血红蛋白的提取和分离,专题,5,DNA,和蛋白质技术,1,学习导航,1.,通过阅读教材,P,64,“,基础知识,”,，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的,原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。,2.,分析教材,P,66,“,实验操作,”,，掌握蛋白质提取和分离的过程。,3.,阅读教材,P,69,“,操作提示,”,，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。,重难点击,1.,尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程,和方法。,2.,了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。,2,一、蛋白质的分离技术,当堂检测,二、实验操作和操作提示,内容索引,3,一、蛋白质的分离技术,4,基础梳理,1.,蛋白质的分离依据,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和,、所带,的性质和多少、溶解度、,和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,2.,凝胶色谱法,(1),概念：也称做,，是根据,分离蛋白质的有效方法。,大小,电荷,吸附性质,分配色谱法,相对分子质量的大小,5,(2),凝胶的特点,(3),常用凝胶：,或琼脂糖。,(4),分离原理,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程,，移动速度,，通过凝胶的时间,。,相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶,_,移动，路程,，移动速度,，通过凝胶的时间,。,形态：微小的,_,组成：大多数由,构成,结构：内部有许多,_,多孔球体,多糖类化合物,贯穿的通道,葡萄糖,较长,较慢,较长,外部,较短,较快,较短,6,3.,缓冲溶液,(1),作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制,对溶液,pH,的影响，维持,pH,基本不变。,(2),配制：通常由,1,2,种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的,_,就可以制得,的缓冲液。,(3),意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持,_,与体内环境中的,pH,基本一致。,外界的酸和碱,使用,比例,在不同,pH,范围内使用,体外,溶液的,pH,7,4.,电泳,(1),概念：带电粒子在,的作用下发生,的过程。,(2),原理,带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有,的基团，在一定的,pH,下，这些基团会带上,。,迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其,_,的电极移动。,分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子,以及分子本身的,、,的不同，使带电分子产生,，从而实现样品中各种分子的分离。,(3),常用的电泳方法：,电泳和,电泳。,电场,迁移,可解离,正电或负电,所带电荷相反,带电性质的差异,大小,形状,不同的迁移速度,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,8,问题探究,1.,凝胶色谱法,(1),结合,右,图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表,分析不同大小的分子洗脱后的次序。,相对分子质量大,相对分子质量小,直径大小,_,_,运动方式,_,无规则的扩散运动,运动路程,较短,_,运动速度,_,较慢,洗脱次序,先流出,后流出,较大,较小,垂直向下运动,较长,较快,9,答案,相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进,入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋,白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。,(2),结合,右,图，分析为什么相对分子质量较大的蛋,白质会先从色谱柱中洗脱出来？,答案,不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。,(3),凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？,答案,10,答案,各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。,2.,电泳,(1),从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？,答案,答案,否。因为,SDS,能与蛋白质结合，形成蛋白质,SDS,复合物，,SDS,它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。,(2)SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？,11,归纳总结,琼脂糖凝胶电泳和,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别,(,1,),分离原理不同,琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。,(,2,),用途不同,琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。,12,拓展应用,1.,凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是,A.,相对分子质量较小的蛋白质,B.,相对分子质量较大的蛋白质,C.,凝胶颗粒,D.,葡萄糖或琼脂糖分子,解析,凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。,答案,解析,13,2.,有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是,A.,它们都是分离蛋白质的重要方法,B.,它们的原理相同,C.,使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要,D.,以上说法都正确,解析,不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以,A,正确；,B,错误；,这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以,C,错误。,答案,解析,14,二、实验操作和操作提示,15,基础梳理,1.,样品处理,(1),红细胞的洗涤,目的：去除,。,方法：,。,标准：直至上清液不再呈现,。,(2),血红蛋白的释放,杂蛋白,低速短时间离心,黄色,蒸馏水,10,16,(3),分离血红蛋白溶液,分层结果,(,自上而下,),：,第,1,层：无色透明的,。,第,2,层：脂溶性物质的,白色薄层固体。,第,3,层：,的水溶液,透明液体。,第,4,层：其他杂质的暗红色沉淀物。,结果处理：将试管中的液体用,过滤，除去,沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的,液体。,2 000,10,甲苯层,沉淀层,血红蛋白,红色,滤纸,脂溶性,红色透明,17,2.,透析,粗分离,(1),过程：取,1 mL,的,溶液装入,中，将其放入盛有,300 mL,的物质的量浓度为,20 mmol/L,的,中,(pH,为,7.0),，透析,12 h,。,(2),原理：透析袋能使,自由进出，而将,保留在袋内。,(3),目的：去除样品中,的杂质。,血红蛋白,透析袋,磷酸缓冲液,小分子,大分子,相对分子质量较小,18,3.,凝胶色谱操作,纯化,(1),凝胶色谱柱的制作,(2),凝胶色谱柱的装填：凝胶用,充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，,缓慢倒入凝胶色谱柱内,蒸馏水,一次性,19,(3),样品的加入,(4),洗脱：,下端出口，加入磷酸缓冲液，连接,，,_,下端出口，进行洗脱,加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢,下降到与凝胶面,，关闭出口,加样：用吸管小心地将,1 mL,透析后的样品加到色谱柱,的,，注意不要破坏凝胶面,加样后：打开下端出口，使样品渗入,内,平齐,顶端,凝胶床,关闭,缓冲液洗脱瓶,打开,20,4.SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,纯度鉴定,判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行,的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是,。,5.,操作提示,(1),红细胞的洗涤：,、离心速度与,十分重要。洗涤次数过少，无法除去,蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。,蛋白质纯度,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,洗涤次数,离心时间,血浆,21,(2),色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在,中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。,(3),凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的,，降低,。,(4),蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。,洗脱液,洗脱次序,分离效果,22,问题探究,1.,实验操作过程,(1),材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,答案,哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,答案,23,答案,洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。,(2),洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？,答案,蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；,甲苯是有机溶剂，可以溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。,(3),在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？,答案,24,(4),血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？,答案,分为,4,层：从上往下数，第,1,层为无色透明的有机溶剂,(,甲苯,),，第,2,层为白色的脂类物质，第,3,层为红色透明的血红蛋白溶液，第,4,层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。,分层的液体,过滤除去脂溶性沉淀层,分液得下层的血红蛋白溶液。,答案,(5),将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？,答案,血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。,25,2.,凝胶色谱操作,(1),在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？,答案,凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离，凝胶色谱柱的高度不足会导致达不到分离效果；,凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果，但直径过大会导致洗脱液体积大，样品稀释度大，使实验现象不明显。,答案,26,(2),试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？,答案,如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，影响分离的效果。,答案,(3),在装填凝胶柱时，如果有气泡存在，会对蛋白质的分离有何影响？,答案,气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,27,归纳总结,血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的,操作,目的,红细胞的洗涤,去除杂蛋白，如血浆蛋白,血红蛋白的释放,使红细胞破裂，释放血红蛋白,分离血红蛋白溶液,经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开,透析,除去样品中相对分子质量较小的杂质,纯化,除去相对分子质量较大的杂质蛋白质,28,拓展应用,3.,下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中，不正确的是,A.,加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下,降到凝胶面的下面,B.,用吸管小心地将,1 mL,透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,C.,加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,D.,等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,答案,解析,29,解析,加样前，应打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口，而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面，,A,项不正确。,加样时不要破坏凝胶面，,B,项正确。,加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，,C,项正确。,等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再加缓冲液，,D,项正确。,30,4.,右,图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：,(1),血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有,功能。,运输,解析,血红
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