第四组SDS-PAGE测定酶

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-PAGE,测定酶,目录,一、实训目的,二、实训原理,三、实训材料,四、实训步骤,一、实训目的,掌握,SDS-PAGE,电泳技术的原理、凝胶配制等知识,能够熟练进行加样,能够正确使用电泳仪,二、实训原理,1.SDS-PAGE,分离样品的主要依据是各种物质分子量的差异性。当,SDS,与各种酶分子结合后，酶分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷。因此在电泳时，电泳迁移仅取决于分子量大小而与其所带的电荷无关。,三、实训材料,1.,试剂,30,丙烯酰胺溶液,(,Acrylamide-Bis,),配置,100mL:29,克丙烯酰胺，,1,克甲叉双丙烯酰胺，置于,250mL,烧杯中，向烧杯中加入约,80mL,的去离子水，充分搅拌溶解，最后定溶,100mL,，置于棕色瓶,4,保存。,0.5moL/L,浓缩胶缓冲液,配置,100mL,：,6.0,克,Tris,，置于,100mL,烧杯中，加,80mL,去离子水搅拌溶解；用,HCl,调节,pH,值到,6.8,，加水混匀定容至,100mL,。,1.5moL/L,分离胶缓冲液,配置,100mL,:18.2,克,Tris,、,置于,100mL,烧杯中，加,80mL,去离子水搅拌溶解；用,HCl,调节,pH,值到,8.8,，加水混匀定容至,100,mL,。,5xTris-,甘氨酸电极缓冲液,组分浓度,0.125moL/L,Tris,，,1.25moL/L Glycine,0.5%(m/v)SDS,；,配置,1L,：,15.1,克,Tris,，,94,克甘氨酸、,5,克,SDS,，加水混匀定容至,1L,，室温保存,10,（,m/v,）过硫酸铵,配置,10mL,：,1,克过硫酸铵溶于,l0ml,蒸馏水中，临用前配制。,10,（,m/v,）,SDS,配置,10mL:,配置方法同过硫酸铵,2x,样品处理液,组分,100mmol/L,Tris-HCl,（,Ph6.8,），,4%,（,m/v,）,SDS,0.2,（,m/v,）溴酚兰,20%,（体积倍数）甘油，,2%,（,m/v,）,-,巯基乙醇；,配置量,5mL,：取,1mol/L,Tris-HCl,（,Ph6.8,）,0.5mL,，,SDS 0.2g,，溴酚蓝,10mg,，甘油,1mL,，加水溶解定溶至,5mL,。小份分装，,0.5mL,一管，室温保存。使用前将,25L,的,-,巯基乙醇加入混匀,考马斯亮蓝染色液,配置量,1000mL,：称取,0.125%,考马斯亮兰,R-250 1.25g,，,250mL,甲醇或乙醇，,80mL,乙酸，加蒸馏水补足,1000mL,。充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。,脱色液,7,醋酸,蛋白质样品,46kda,的酶,其他试剂,15g/L,琼脂糖溶液（封胶用）（用,1x,Tris,-,甘氨酸电极缓冲液配置）,2.,仪器,1.,电泳仪,2.,电泳槽及灌胶模具,3.,电炉,4.,微量移液器,5.,烧杯、量筒、摇床等,四、实训步骤,1.,准备工作,将垂直板型电泳装置的玻璃片洗干净，晾干，嵌入凹槽中，夹好。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。,2.,分离胶的制备,按比例取试剂立即混匀，将混合液，迅速在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加,0.51cm,）。用滴管小心地在溶液上覆盖一层蒸馏水，以隔绝空气中的氧气，并使胶面平整。将电泳槽垂直静置于室温约,1h,或更长，待分离胶聚合完全后（水封层和凝胶面之间会出现明显的水胶分界线），倾出覆盖的水，再用滤纸吸净残留水（注意勿将滤纸碰到胶面）。准备灌注浓缩胶。,3.,浓缩胶的制备,在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，梳底距离分离胶至少有,0.51cm,。,4.,样品的处理,在待测酶样品中按,1:1,体积比加入,2,倍样品处理液，在,100,沸水中加热,35min,以使酶变性。另外选择相对分子量大小合适的标准蛋白质作为参照，并做同样处理。,5.,加样,待浓缩胶完全聚合后，小心移出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将凝胶固定于电泳装置上，槽中加入,Tris,-,甘氨酸电极缓冲溶液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。用微量注射器向凝胶梳孔内加样，动作轻缓、准确、迅速，防止窜孔。,6.,电泳,接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。电泳时，调节电流至,2030mA,并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约,1cm,时，关闭电源停止电泳。,7.,剥胶,电泳结束后小心从电泳装置上卸下玻璃板，将胶取出，注意凝胶的完整性。,8.,染色和脱色,经,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的酶样品可用考马斯亮蓝,R250,染色。将凝胶完全浸入固定染色液中放摇床上，轻轻摇动使染色均匀，染色,12h,或过夜，至显出条带。染液收回，用水洗去凝胶表面染液，加脱色液脱色，需,310,小时，期间更换多次洗色液至背景无色。,9.,凝胶保存,可用,7%,醋酸或,20%,甘油保存，也可拍照、扫描或脱水制成干胶保存。,10,、相对分子质量的计算,10,、相对分子质量的计算,（,1,）电泳相对迁移率的计算,用直尺分别量出标准蛋白质、待测酶区带中心以及溴酚蓝距分离胶顶端的距离，按以下公式计算相对迁移率：,（,2,）标准曲线绘制,以各标准蛋白样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量（,M,r,）的对数值为纵坐标，在坐标纸上作图，可拟合绘制一条标准曲线。,（,3,）待测酶样品相对分子质量的计算,根据待测酶样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量的对数值，再进一步算出酶样品的相对分子质量。,分离胶,分离胶（单位,kD,）,150,以上：,6%,；,100150,：,8%,；,50100,：,10%,；,2050,：,12%,；,20,以下：,16%,。,一般为这个范围，也可有些许的差异。,分离胶制备 （,12% 10ml),H,2,O 3.35ml,1.5M Tris(PH8.8) 2.5ml,10% SDS 0.1ml,Acr/Bis,4.0ml,10%,过硫酸铵,0.05ml,TEMED 0.005ml,浓缩胶制备 （,5% 5ml),H,2,O 3.6 ml,单体溶液（,30%,）,0.62ml,1M Tris(PH6.8) 0.63ml,10% SDS 0.05ml,10%,过硫酸铵,0.05ml,TEMED 0.005ml,压缩胶一般都为,5%,；,谢谢观看,