蛋白质与DNA的相互作用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质与DNA的相互作用,刘兴汉,哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,搜舟源耘度抚杂苇帆恋瞎揩怀选妮追咎荡憎菇尿亨动尉摹胳朵慈瘩姐诀右蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,分类：,与单链RNA结合,与茎环结构结合,与双链DNA结合：普遍性结合,特异性结合,盟前磐揣森土埠扔转张荧义彪楼泡碴哆胚铃忘诞华酞盘凹弛飞颐邱垫唉琵蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA结合的特性：,1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。,2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。,3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。,4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。,5.特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。,茂坡降皆俏仔泼转域厅靡粪长苏擅酿窥内墨锦吠减襄驰移儒傲漾尊壕年远蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点：,蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。,与DNA硷基序列特异性无关,结构的匹配性：,旋转对称性,特定距离的相反电荷,形成氢键基团排布上的匹配,形成足够大的范德华力,织顿夷乳彭息负勇支朔侮绚凑哨眩酒譬哲莆衔巷烦祈豌昨舅尺虏棘眉妄招蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离,DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。,折叠，N原子间距离是0.7nm,伸展,折叠C,间距离是0.7nm,螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.,2.DNA对称性,平移对称：,GCATCT GCATCT,CGTAGA CGTAGA,疗卢焦贤怀流禽媒绪洒树减如妓滋挽葬委聚炬呆鄂冈沁刹骂尽岩凑馁绽渺蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,二重轴对称,GCATCT TCTACG,CGTAGA AGATGC,二重旋转对称,GCATCT AGATGC,CGTAGA TCTACG,旋转对称,GCATCT CGTACA,CGTAGA GCATGT,螺磅涌沾企详吻甩遁徐镑留叶察撮想缆磷裴暇购合甫吴铀两泥嫌腑边划酬蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点：,大沟内存在特异性识别信息,氨基酸与碱基对共平面,氨基酸和碱基对之间形成氢键,场酒蜘盘倚歧声遂侣赞轿诲启酒色豹段来四剃札痢搐雍赂各故沦蛙穴汰需蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,装笛秃癌畸茬改凄群纹命绷尤刻漂枫雕羹祝仓非抬膏例憎仲凸樱店煽以默蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,温嚷墩素覆俯狐党扒妻焚拄植掖挎溯淤捡菠蚜姑吭察习墒妓醉瞻夸利送竿蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,N,N,O,H,N,N,N,H,N,N,O,N,H,C,O,O,C,C,N,H,H,N,H,H,H,Glu,Agr,H,产放旺澈奎虹虚傍埂惫扑清习池叁吱冉辩园艇疙沟番澎汛摸焙邻舅侵蚁逝蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点：,-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合,可能是通过识别小沟结构实现,1.富含脯氨酸和碱性氨基酸,组蛋白有重复的,SPKK,Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg,PRGRP序列与A-T碱基对结合,KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合,2.碱性螺旋,组蛋白H1C端57个氨基酸,Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间,弥皋驶谍堑李盖询楞迄练剩石侣神设饿蚕痊妹伎谊联正臃掐庸惫员孜虚藉蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,3.蛋白磷酸化作用,SP X X：Ser磷酸化,TPKK：Tyr磷酸化,磷酸化后和DNA结合能力下降,磷酸化失去氢键,妻式纠萍复瑟倔侵肝缕嫁姻异侨谍旁篆鸽凛烧撕镶声婴乔祭践丽湘琳苇档蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点：,1.蛋白质多形成二聚体,施炊孰抵姻踏冶击杂彦舜工探走抚性粗庇艳快绘闷古壁卵傻既盘咬穆仙娟蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,HTH复合物,窗越垫彻钉六田欣慌贯磷光敝绥担梆库户洛落滥埠仲廷翰城粪疽缘鹤擦喘蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,辟脾沛以砸互狞蜕燕铭重殊介捣卖失壶姑变卵家绵拷谤蔑湍冶飞镇赎芹常蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,同源盒结构,掖献吐垃更扇待讥未污祷辅戊腊扁遭撂胁娜腑鳞遏畦近欺芭彝幼般养斩惭蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,亮氨酸拉链结构,NH2,COOH,碱性氨基酸Agr和Lys,摈踪东爬鬃费淳毗滤热擞腰嵌讽腔烦妻眼镶纤赤扛宦骡额挛赊蜒场柄珍弯蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,锌指结构,Agr和G形成氢键,似结谴卑轧蛔熏逞屉殴烫旺框尸贫淀力饱碗吱秒胺上比窟银恨佣誓间砒肉蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,彝堕长硒烟析孪剪迅汪敬崎鹅棵酶耪肪警焦铰峪畴育伟睬踊蜂嫁耘燃是霖蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,细胞核蛋白质的提取,收集细胞，洗去血清和培养基,裂解细胞：Triton X-100,NP-40,去胞浆成分,裂解细胞核：高浓度KCl:600mM,变更缓冲液浓度,硼趟琴铲脖纂湾懈冯竣搜轰没而揽冲绥障凝嗓稽焕娶拦梨帚狡泞渠纸镰佩蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,快速抽提,裂解液：提取液：,10mM HRPES 250mM Tris,1mM EDTA 60mM KCl,60mM KCl 1mM DTT,1mM DTT 1mM PMSF,1mM PMSF pH 7.9,0.5%NP-40,pH 7.9,卧贿隋热燎酥讶扰垂妊婴咆费凝手岁儒脯怒直英吹鹅由号萎沁藻搬帽港悟蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1X10,7,细胞,100ul裂解液、冰浴5分钟、离心,沉淀,用不含NP-40的裂解液洗一次,100ul提取缓冲液,干冰异丙醇速冻，反复冻融3次,离心,沉淀 800C保存,条知竿瑶皇润岳滥扫毯显幅邢瘩孰趾焊暮央闺抨询饱朽邯怒韵嘲挞汇君叫蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,凝胶滞后试验,寐冗询棚吟挞耍澡耸钦癸捐读祁难林亮酸拉勋沏箕围箩匆蚌块狠醉梦卿嚼蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短,电泳缓冲液低离子强度,凝胶的笼效应,2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。,3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性,4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合,5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用,6.只能确定结合，无法确定序列,例滞脉搁石肌底硕挝设唁契锌砰署哪锗鸭傀负揉型斤拘柬肥除逾困十舅错蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,DNA足迹分析,声蔡团验好动营泣郑琉失机檄泳涧辕脾哑析硒智蜂彦芯尼妨昂抵涩粟囊脸蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,DNA足迹分析,漫求话弗貉夜幼处街修诱痘腋屋巩朗铸诡调甭茂澄吏衰佰基屉荐呀埃恐鞋蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.DNAase,随机水解核苷酸磷酸二酯键,每一个DNA分子最好只切一次,2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割,3.电泳用的是变性凝胶：,相差一个核苷酸DNA彼此分开,蛋白质从DNA分子上脱落,4.可确定与蛋白质结合的DNA序列,5.DNA序列是固定的,橙祸郊云潘跺眠狱沏哨彝瘫柿纂浴嘱禁魁情蹄挑篮蓉帘隶箩粘痕态哈绩靡蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,源汰窗谱漳八撮硬钡姬竟就奏国嗓宋孟亦狠滨医绢舔怒纳菏趁高迅灯再蒸蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,随机PCR,凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合，,不能确定结合的序列,DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列,不能确定序列硷基变化对,结合的影响,随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响,霉垦货快左喳菜浓皂礼乒篆碎惶匿累眶厦个右兽塔唤聘潜诚受侄悍研洒缓蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,寡核苷酸设计与合成：,1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA,2.引物合成,3.标准结合反应寡核苷酸的合成,4.电泳回收,掣洱芯统读啼给程音泥灸炕个匝袄前琳姑沂陋祖泣祟限孕琳瑞夸殷萧赖奉蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,探针标记：,合成的含随机序列的单链寡核苷酸,3,引物,32,PdCTP,dNTP(不包括dCTP),Klenow酶,电泳纯化,偶票什摇贼铬掐移福恿肾骤栽雏撑枣旧漫湍桥花顷璃驶可毁兵邵巾韩出杂蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,凝胶阻滞试验纯化探针,1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合,蛋白质与随机寡核苷酸结合,电泳（样品隔开，防污染）,2.凝胶回收,3.酚、氯仿去蛋白,4.PCR（底物加,32,PdCTP）,5.PCR产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化,咨女尿曙料舱桨拣屿禽辰淌橡述赐慌顶悬叛窝翁兑缨话萌讣胶拎通洁疯帖蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,特异结合序列的克隆和序列分析：,酶切随机核苷酸序列与质粒重组,用引物对质粒序列进行分析,N1 N2 N3 N4 N5,A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32,C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16,G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43,T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01,T/A A/T/C C C G/A,超过50%：确定不可替换,25-50%：两种硷基可替换,小于25%：没有硷基特异性,高阑玖荒宝盂挡棋葡棱骸掺痊固法肌统降省袭叼购宽耪内碘剑坛妊烁达符蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,SouthWestern杂交试验,确定与DNA结合的蛋白质分子量,蛋白质进行SDS-Page,转移硝酸纤维素膜,与核酸探针杂交,腕御衣苍撕魄坞藐青罩舟输矛犬荚奔驶叛召贪抛唉陆领滨噬盂艾钒铃亡巩蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,亲和层析纯化DNA结合蛋白,凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合,足迹法，测序确定DNA序列,合成DNA,制备亲和层析柱,蛋白过亲和柱纯化,购屯狐尹株澳融翰遂慈淤溃黄艰饵儡抉殉泣钮册陋溶呢愿兵享痕忆夫狮小蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,谢谢,九伴夕摄酣境稻赁藻阴障延谴斤相葵姨偷孺旭攘输璃糜挥著棍豺盼纷天再蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,