组织化学与细胞化学技术课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组织化学与细胞化学技术,2024/10/4,组织化学与细胞化学技术,组织化学与细胞化学技术2022/9/28组织化学与细胞化学技,组织化学技术:,应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物,学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在,组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及,分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析,仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信,息。,细胞化学技术:,应用组织化学技术于游离细胞的样品(如细胞涂,片)，则称细胞化学技术。,组织化学与细胞化学技术,组织化学技术:组织化学与细胞化学技术,一 组织细胞化学染色,组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下,运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构,及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、,生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的,意义。,组织细胞染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基,酸)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类，采用的,方法通常为化学结合物理溶解显示及酶-底物反应。,组织化学与细胞化学技术,一 组织细胞化学染色 组织细胞化学染色是将形态,组织细胞化学染色方法分门别类有许多种,结果的显,示也不尽相同,有时即使是检测同一物质,因采取的方法,不同,其结果有可能存在一定的偏差,另一些是由于方法,学上本身的缺陷,其结果也可能产生误差,所以我们应注,意选择结果稳定、方法简便(操作步骤越繁复,结果出现,误差的可能性就越多),阳性显示明显的细胞化学染色方,法如果条件允许可与细胞免疫化学、细胞遗传学、分子,生物学等相结合,使细胞化学染色发挥最大、最准确的,作用。,组织化学与细胞化学技术,组织细胞化学染色方法分门别类有许多种,结果的显组织化学,常用组织细胞化学染色,过氧化物酶,peroxidase,(,POX,),1.原理,血细胞中的POX能分解H,2,O,2,而释放出新生态氧，后者,可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。,2.正常阳性细胞:,.中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。,.嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。,.单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。,组织化学与细胞化学技术,常用组织细胞化学染色过氧化物酶 peroxidase,(,单核细胞呈,弥散弱阳性,中性粒细胞呈,粗颗粒强阳性,组织化学与细胞化学技术,单核细胞呈中性粒细胞呈组织化学与细胞化学技术,过碘酸一雪夫反应,periodic acid Schiff reaction,PAS,此试验中能被过碘酸-雪夫反应呈阳性的多糖类物,质有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂、还包括一些磷脂,类物质等，因此PAS阳性不能简单地就表明有糖原的存,在，只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将,PAS阳性认同于糖原。,PAS染色虽然不完全代表糖原，但在血液系统疾病特,别在各类型急性白血病中却有相当大的应用价值。PAS,染色若结合其他化学染色和细胞免疫表型检测可对部,分疾病的诊断和鉴别诊断提供一定的价值。,组织化学与细胞化学技术,过碘酸一雪夫反应periodic acid S,1.原 理,过碘酸氧化多糖类中的乙二醇使之成为双醛基，后,者与无色品红结合形成紫红色化合物。定位于含多糖,类的细胞质内。多糖类物质含量决定了色泽的深浅。,2.参考范围:（正常阳性细胞）,粒细胞系原粒细胞多呈阴性,通常随细胞不断成,熟阳性反应由弱渐强,至细胞完全成熟后达到最大,强度。其中中性粒细胞呈胞浆内弥散状红色阳性,嗜酸粒细胞S颗粒之间的胞浆呈红色阳性,嗜碱粒,细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。,组织化学与细胞化学技术,1.原 理组织化学与细胞化学技术,红细胞系 幼红细胞及红细胞均呈阴性。,巨核细胞系 从原始阶段到血小板均呈阳性。,淋巴细胞系 大多数淋巴细胞呈阴性，小部分,淋巴细胞成阳性。,单核细胞系 原始阶段呈阴性，幼稚阶段以后,可见浆内呈弥散细小颗粒状红色阳性。,浆细胞系 大多数浆细胞呈阴性，小部分浆细,胞呈阳性。,组织化学与细胞化学技术,红细胞系 幼红细胞及红细胞均呈阴性。组织化学与细胞化学,中性粒细胞碱性磷酸酶,neutrophil alkaline phosphatase,(NAP),1.原理,细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚，使,之释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。,定位于酶活性所在处。,2.参考范围,：,中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2%56%,积分 480 分/100个中性粒细胞,组织化学与细胞化学技术,中性粒细胞碱性磷酸酶neutrophil alka,NAP,染色结果,(+)(+),固紫-,B,组织化学与细胞化学技术,NAP染色结果组织化学与细胞化学技术,二 组织细胞免疫化学标记技术,组织细胞免疫化学是细胞化学吸收了免疫学的理论和技术而发展起来的一门重要方法学.在现代医学领域中被广泛应用.尤其在组织细胞学中该技术的应用是微观世界形态学研究从单一的形态学描述上升到结构、功能和代谢为一体的动态观察。并可对细胞的属性、分化阶段和变异进行鉴别，有助于临床疾病的诊断。,组织化学与细胞化学技术,二 组织细胞免疫化学标记技术 组织细胞免疫化学是细胞化学,组织细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的时间，但其发展异常迅速，检测方法可多达20多种以上。其基本原理是将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异抗体产生抗原抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来，进行观察和分析。,组织化学与细胞化学技术,组织细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的,目前实验室常用的方法有免疫荧光法，PAP法，ABC法、IGSS法等10大类。但由于各种方法均有其特性和检测适应范围，即某一种方法无法在所有的检测标本中被应用，我们应充分发挥各种方法上的特点。有选择性的将不同来源的组织和细胞标本并选用不同的方法来进行检测。使我们的检测结果更精确。,组织化学与细胞化学技术,目前实验室常用的方法有免疫荧光法，PAP法，ABC法、,一,免疫荧光细胞化学技术,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与,显微显示的精确性相结合。用已知的抗体在不影响其免,疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光,素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测,和鉴定。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以,直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记,抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基,罗丹明（RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）及,藻红蛋白（PE）在流式细胞术（FCM）中较常用。较为经,典的方法有下列几种：,组织化学与细胞化学技术,一免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特,（一）,直接法,是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。,依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的,优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制,备大量特异性的荧光抗体。,（二）,间接法,间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗,体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间,后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素,标记抗抗体使之形成被检抗原抗体荧光素标记抗抗体,复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光,标志物，所以其敏感性比直接法要高。,组织化学与细胞化学技术,（一）直接法组织化学与细胞化学技术,组织切片,组织切片,直接法,间接法,Ab,1,-荧光,Ab,1,Ab,2,-荧光,免疫荧光法原理图,组织化学与细胞化学技术,组织切片组织切片直接法间接法Ab1-荧光Ab1Ab2-荧光免,（三）补体法,这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补,体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原抗,体抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易,出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。,（四）双标记法,运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特,点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一,标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接,法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，,甚至可进行三重或多重标记法。,组织化学与细胞化学技术,（三）补体法组织化学与细胞化学技术,单色荧光染色,组织化学与细胞化学技术,单色荧光染色组织化学与细胞化学技术,双色荧光染色,组织化学与细胞化学技术,双色荧光染色组织化学与细胞化学技术,MAL 萤光标记：黄（CD19 ）红（CD13）,组织化学与细胞化学技术,MAL 萤光标记：黄（CD19 ）红（CD13）组织化,多色荧光染色,组织化学与细胞化学技术,多色荧光染色组织化学与细胞化学技术,二、免疫酶细胞化学技术,免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。选用的标记酶有辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、D半乳糖苷酶（DGal）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且部分已制成试剂盒出售。目前已广泛地被临床和实验室所应用,组织化学与细胞化学技术,二、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体,细 胞,二步酶标法,三步酶标法,Ab,1,-酶基团,Ab,1,Ab,2,-酶基团,免 疫 酶 标 法 原 理 图,组织化学与细胞化学技术,细 胞二步酶标法三步酶标法Ab1-酶基团Ab1Ab2,（一）辣根过氧化酶免疫酶标记法,辣根过氧化酶是从辣根中提取的一种糖蛋白，其作用底物为供氢体和过氧化物。目前常用的供氢体为二氨基联苯胺（DAB）。在酶反应过程中DAB不断供给复发物电子，使其成为在光镜下能观察到的不溶性深棕色多聚合物。定位与酶活力处即抗原抗体反应部分。,现常用的方法有-直接法;间接法;抗体桥联法;过氧化酶抗过氧化酶复合物法（PAP）;亲和素生物素过氧化酶复合物法（ABC）等。在组织细胞相关抗原检测中通常使用PAP法和ABC法这两种。,组织化学与细胞化学技术,（一）辣根过氧化酶免疫酶标记法 辣根过氧化酶是从辣根,（二）免疫碱性磷酸酶标记法,碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶。从大肠杆菌中提取的此酶最适PH为8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚ASMX和磷酸萘酚ASBI，显色的偶联剂可采用固红-GBC和固蓝-BB等。免疫碱性磷酸酶染色方法很多，有直接法；间接法；APAAP法；ABCAP法；但APAAP法和ABCAP法二种，较为常用，且这二种方法其敏感性和特异性均较满意。,组织化学与细胞化学技术,（二）免疫碱性磷酸酶标记法组织化学与细胞化学技术,细胞,Ab-1（Mo）,Ab-2（Ho）,Ab-3（Mo）,免疫酶桥联(APAAP)法染色原理,组织化学与细胞化学技术,细胞 Ab-1（Mo）Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）免,Ab-1,细胞,生物素化二抗,ABC复合物,生物素化,Biotion（HRP/AP）,ABC法染色,原理图,卵白素,（Avidin）,组织化学与细胞化学技术,Ab-1 细胞生物素化二抗 ABC复合物生物素化Bioti,三、多聚螯合物法(ELPS),（一）多聚螯合物法的特点,多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术，其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。此法是近几年来发展较